Detecção de vírus da videira por RT-PCR em tempo real e por extensão de primers alelo-específicos e caracterização molecular de isolados do Nordeste Brasileiro - CATARINO, Aricléia de Moraes (2015)
A videira (Vitis spp.) pertence à família Vitaceae, sendo as espécies botânicas V. vinifera L. e V. labrusca L. cultivadas em maior escala devido seus produtos, consumidos na forma de frutos in natura, geleias, sucos e vinhos. Apesar da grande importância econômica, vários fatores podem comprometer a produção desta cultura, incluindo as doenças causadas por vírus. O presente trabalho teve como objetivos verificar a incidência de vírus presentes em vinhedos comerciais de duas áreas produtoras do Nordeste do Brasil e avaliar a eficiência de alguns métodos moleculares para detecção e identificação de espécies virais associadas à videira. Amostras, apresentando ou não sintomas, foram coletados de genótipos de videira em propriedades situadas em Pernambuco, Paraíba, Bahia e Rio Grande do Sul, Brasil, e em Locorotondo, Província de Bari, Região da Puglia, Itália. A primeira parte do trabalho foi conduzida no Laboratório de Virologia da Embrapa Uva e Vinho, RS, Brasil. Visando a identificação dos agentes virais, nas amostras coletadas no Brasil, foram realizadas as extrações do RNA total, obtidos os cDNAs e testados por PCR em Tempo Real, empregando-se primers e sondas, específicos para os seguintes vírus: Grapevine rupestris stem pitting-associated virus (GRSPaV), Grapevine virus A (GVA), Grapevine virus B (GVB), Grapevine leafroll-associated virus 2, 3 e 4 (GLRaV-2, -3 e -4), Grapevine fleck virus (GFkV), Grapevine rupestris vein feathering virus (GRVFV) e Grapevine fanleaf virus (GFLV). Fragmentos de DNA, produtos da RTq-PCR, correspondentes ao gene da CP de cada vírus foram eluídos, ligados ao vetor pGEM-T Easy (Promega) e utilizados na transformação de bactéria. Foi extraído o DNA plasmidial das colônias bacterianas transformadas, confirmando-se a presença dos fragmentos clonados, os quais foram sequenciados. A segunda parte, realizada com o material coletado em Locorotondo, foi processada no Istituto per la Protezione Sostenibile delle Piante (CNR-IPSP) e no Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta e degli Alimenti, Università degli Studi “Aldo Moro”. Foram utilizadas, a partir de cDNAs obtidos, técnicas de amplificação baseadas na Allele Specific Primer Extension (ASPE), visando detectar em teste multiplex os vírus mais relevantes envolvidos na etiologia da degenerescência e nos complexos do enrolamento das folhas e do lenho rugoso da videira. Os resultados obtidos mostraram que as técnicas agregam algumas vantagens, como a redução no tempo e relativa simplicidade de execução, eliminando completamente o uso de reagentes tóxicos, a exemplo do brometo de etídeo. O uso de multiplex facilita a amplificação de múltiplos alvos em uma única reação, reduzindo o tempo e o custo das análises.