Imobilização de proteases colagenolíticas obtidas de Aspergillus sclerotiorum URM 5792 em nanopartículas magnéticas revestidas com quitosana - SILVA, Munique Cristiane Tavares Santos (2021)
As proteases são enzimas quem têm sido extensivamente utilizadas em diversos segmentos da indústria. Apesar de apresentar elevado interesse e inúmeras vantagens, sua aplicação expõe ainda algumas limitações. O processo de imobilização tem se tornado uma alternativa, visto que pode aumentar a estabilidade enzimática e promover a reutilização por vários ciclos. A utilização de suportes magnéticos tem sido amplamente explorada, devido a sua versatilidade no setor da biotecnologia de purificação de biomoléculas, e seu revestimento com suportes orgânicos como a quitosana, facilitam o processo, impedindo a oxidação das nanopartículas magnéticas (NPM’s), conferindo propriedades ideais para a imobilização. O presente trabalho teve como objetivo selecionar, imobilizar e caracterizar proteases colagenolíticas obtidas de Aspergillus scletotiorum URM5792 em NPM’s revestidas com quitosana. Para produção foi realizado um planejamento fatorial completo 22; tendo como melhor condição de produção (7g de farelo de trigo e 60% de umidade, submetidas a 30°C por 72h de fermentação, com atividade proteolítica de 56,27 U/mL e colagenolítica de 303,00 U/mL). O processo de imobilização foi realizado utilizando planejamento fatorial completo 23 visando avaliar a influência das variáveis independentes: concentração de glutaraldeído, tempo de ativação e tempo de imobilização sob o rendimento de imobilização enzimática. No ensaio composto por 4% de concentração de glutaraldeído, 2,5h de ativação e 1,5h de imobilização foram obtidos rendimentos de 86,25% para atividade proteásica e 83,83% para atividade colagenolítica. A enzima imobilizada apresentou mais de 95% da atividade inicial após 28 dias de armazenamento e reteve mais de 60% da atividade residual no décimo segundo ciclo de reutilização. Também foram analisadas a influência do pH e temperatura sob a atividade enzimática na forma livre e imobilizada, ambas apresentaram pH ótimo na faixa de 9,0, assim como, temperatura ótima de 30°C e 40°C, respectivamente. A estabilidade ao pH e à temperatura da enzima livre se manteve com mais de 80% e 60% de atividade residual nos tempos de 24h e 180min, respectivamente. E a estabilidade da enzima imobilizada se manteve com 60% e 70% de atividade residual nos mesmos tempos. A fermentação em estado sólido foi eficaz com alta produção enzimática e a imobilização da protease colagenolítica em nanopartículas magnéticas revestidas com quitosana e ativadas em glutaraldeído, mostraram ser métodos eficientes no rendimento, armazenamento e reuso da enzima. A enzima imobilizada apresentou maior afinidade ao substrato em relação à enzima livre, foi inibida pelo íon Cu2+, SDS e PMSF indicando a presença de uma serino-protease. Esses resultados indicam que Aspergillus sclerotiorum URM 5792 é uma fonte potencial para a produção de protease colagenolítica com possíveis aplicações biotecnológicas em diversos setores da indústria, na produção de detergentes, no setor têxtil e na indústria farmacêutica, no tratamento e regeneração de tecidos em necrose. Palavras-chave: Aspergillus,