Produção e extração de proteases colagenolíticas obtidas de Aspergillus heteromorphus URM 0269 e sua imobilização em alginato - FERNANDES, Lígia Maria Gonçalves (2020)
Este trabalho objetivou produzir, imobilizar em alginato de cálcio, extrair em sistemas de duas fases aquosas (PEG/Citrato) e caracterizar proteases colagenolíticas obtidas de Aspergillus heteromorphus URM 0269. Para tanto, no primeiro momento, realizou-se uma fermentação em estado sólido (planejamento fatorial 22); obtendo-se a melhor condição de produção (3g de farelo de trigo e 20% de umidade, submetidos a 30ºC após 96 horas de fermentação, com atividade proteolítica e colagenolítica de 41,36 U/mL e 401,06 U/mL, respectivamente). A protease colagenolítica contida no extrato enzimático foi imobilizada por aprisionamento em esferas de alginato, sendo realizado um planejamento fatorial 22 onde foi obtido as melhores condições (CaCl2 0,6M; Alginato de sódio 4%), apresentando rendimento de 82,82% para atividade proteolítica e 94,58% de atividade colagenolítica. Esta enzima imobilizada reteve mais de 40% da atividade residual no terceiro ciclo e apresentou 36,82% de perda da atividade após 7 dias de armazenamento a 4°C. Também foram analisados pH e temperatura ótima, bem como as estabilidades. No segundo momento, foi realizado um planejamento fatorial (24) para purificação da protease colagenolítica utilizando o Sistema de duas fases aquosas (SDFA), tendo como variáveis independentes: massa molar de PEG (MPEG), concentração de PEG (CPEG), concentração de citrato de sódio (CCIT) e pH. Posteriormente, a protease extraída por SDFA foi utilizada para hidrólise da azocaseína e caracterizada em termos de parâmetros bioquímicos, cinéticos e termodinâmicos. A enzima foi particionada preferencialmente para a fase rica em PEG cujo maior fator de purificação e recuperação (PF = 7.8 e Y= 157.5%) foi obtido usando MPEG 8000 g/mol, CPEG 24%, CCIT 15% e pH 8,0, apresnetando-se estável a temperaturas de 10 a 30°Ce condições de pH de 5,0 a 6,0. A enzima particionada foi inibida parcialmente por PMSF. Os parâmetros cinéticos de ativação para hidrólise da azocaseína revelaram afinidade por azocaseína (KM = 2,8 mg/mL) com taxa máxima de catálise de 45,0 U/mL. A energia de ativação da reação e a variação de entalpia padrão do desenvolvimento da enzima foram de 24,2 e 54,2 kJ/mol, respectivamente. A hidrólise de caseína catalisada por protease a 25°C mostrou energia livre de Gibbs de ativação, entalpia e entropia de 65,8 kJ/mol, 21,8 kJ/mol e -146,7 J/mol.K, respectivamente. Os parâmetros termodinâmicos da termoinativação da protease no SDFA sugerem um mecanismo predominante de desdobramento reversível, uma vez que a inativação da energia livre de Gibbs aumentou de 91,0 para 102,3 kJ/mol. A fermentação em estado sólido foi eficaz com alta produção enzimática e a imobilização da protease colagenolítica em alginato de cálcio, mostrou ser um método eficiente no rendimento, armazenamento e reuso da enzima. Através de um processo rápido e econômico, a enzima foi purificada por SDFA, permitindo a remoção de contaminantes no extrato enzimático obtido de Aspergillus heteromorphus URM0269. Esses resultados indicam o potencial da protease colagenolítica a ser explorada em aplicações biotecnólogicas, como nas indústrias de curtume, de tenderização de carnes e uso biomédico.