Purificação e caraterização de uma protease alcalina do resíduo de processamento da Carapeba prateada (Diapterus rhombeus) - SILVA, Janilson Felix da (2009)
A Carapeba prateada (Diapterus rhombeus) é uma espécie de relevante representatividade dentre a comunidade pesqueira da região nordeste do Brasil. Ainda nessa região, a pesca artesanal é a mais representativa apesar de registros de cultivo da carapeba em sistemas extensivos. Dentre as partes do peixe não consumidas encontramse as vísceras que correspondem a 5% do peso total dos animais. Desta forma, ao serem descartadas, sem tratamento, esses resíduos representam grave problema ambiental. Entretanto, por serem ricas em enzimas digestivas, viáveis para utilização em determinados processos biotecnológicos essas vísceras representam uma importante fonte alternativa de enzimas industriais. Visando essas informações, o objetivo do presente trabalho foi purificar e caracterizar uma protease alcalina das vísceras de D. rhombeus. Para tanto, vísceras de carapeba prateada foram utilizadas para obtenção de um extrato bruto posteriormente utilizado para purificação enzimática. O processo de purificação foi realizado em três etapas: tratamento térmico (45oC por 30min), precipitação com sulfato de amônio e cromatografia de exclusão molecular (Sephadex G-75). Ao final do processo de purificação obteve-se um incremento de 86,80 vezes na atividade específica e um rendimento de 22,34%. Uma alíquota do extrato purificado foi aplicada em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e o seu peso foi estimado em 24,5 kDa. O pH ótimo e a temperatura ótima para a atividade enzimática foram 8,5 e 55 °C, respectivamente. A enzima demonstrou ser sensível a temperaturas superiores a 45 ºC, após incubação por 30 min, perdendo 100% de sua atividade. Os valores de Km e do Kcat da protease foram 0,266 mM e 0,116 s-1 μM -1, respectivamente, usando benzoil-DLarginina- p-nitroanilida (BAPNA) como substrato. Sua atividade foi aumentada na presença dos íons K+, Li+, Ca2+, Mn2+ e Ba2+ e inibidas pelos íons Fe2+, Cd2+, Cu2+, Al3+, Hg2+, Zn2+ e Pb2+. Testes com inibidores de proteases mostraram que a enzima foi fortemente inibida por TLCK e benzamidina, inibidores clássicos de tripsina. A sequência dos 15 primeiros aminoácidos do N-terminal da protease foi IVGGYECTMHSEAHE e mostrou alta homologia com tripsinas de diversas espécies de peixes. Os dados obtidos demonstram que enzima purificada é uma tripsina com características compatíveis para ser empregada na indústria biotecnológica.