Insulina afeta o desenvolvimento de folículos pré-antrais ovinos cultivados in Situ - SILVA, Diogo Manoel Farias da (2019)
A insulina pode desempenhar, no cultivo in vitro, efeitos sobre a foliculogênse os quais permitiram uma maior obtenção de folículos pré-antrais para posterior produção de embrião. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi determinar o efeito do hormônio insulina sobre o cultivo in vitro de fragmentos ovarianos da espécie ovina, associando ou não com FSH. Para ovários foram coletados em matadouros e armazenados em meio MEM-HEPES a 4 °C e levados ao laboratório. Para o cultivo in vitro, foram obtidos fragmentos do córtex ovariano (3x3x2mm) e cultivados em meio α-MEM+ por 8 dias a 39°C com 5% de CO2. Após os cultivos os fragmentos foram processado e analisados na histológica para avaliação morfológica do desenvolvimento folicular (ativação, manutenção da morfologia e diâmetro do oócito e folículo), análise imuno-histoquímica para localização do antígeno de proliferação nuclear e expressão gênica do RNA mensageiro mRNA para o gene apoptótico (caspase 3) e da esteroidogênese (CYP17 e CYP19). O fluxo de informação permitiu separar o estudo em dois experimentos. Experimento 1: Cultivo in vitro dos tecidos, avaliando os efeitos do hormônio insulina nas concentrações de (0, 1, 10, 100, 1.000 e 10.000 ng/mL), sobre a ativação, desenvolvimento e manutenção da morfologia. Experimento 2: Cultivo in vitro com hormônio insulina (0, 1, 100 ng/mL) associada com FSH sobre a ativação, desenvolvimento, manutenção da morfologia, antígeno de proliferação nuclear (PCNA) e expressão dos genes caspase 3, CYP17 e CYP19. No experimento 1 os resultados demonstraram que: Os maiores percentuais de ativação foram observados nas concentrações de 1 e 100 ng/mL do hormônio (P < 0,05), a porcentagem de folículos morfologicamente normais foi significativamente maior (P< 0,05) para os tecidos cultivados em 1 e 10 ng/mL de insulina comparado aos tecidos cultivados apenas em α-MEM+. Com relação ao crescimento não foi observada diferença do diâmetro do oócito e folículo após o cultivo in vitro em nenhuma das concentrações da insulina. Entretanto na concentração de 10,000 ng/mL houve uma redução significativa no diâmetro folicular quando comparado aos tecidos cultivados apenas em α-MEM+ (P < 0,05). No experimento 2: Os resultados demonstraram que após 8 dias de cultivo com as concentrações de insulina (1, 10 e 100 ng/mL) associado com FSH, apresentaram uma maior ativação (P < 0,05). Do mesmo modo, a porcentagem de folículos morfologicamente normais foi significativamente maior na concentração de 10 ng/mL com e sem FSH (P < 0,05). A marcação do PCNA pela imunohistoquímica demonstrou a presença do antígeno no oócito, em todos os grupos analisados, e nas células da granulosa, apenas no grupo que não foi submetido ao cultivo. A porcentagem de pixel para a marcação do PCNA em todas as concentrações de insulina associada ao FSH, foi maiores que os grupos sem FSH (P<0,05). A expressão dos genes CYP17 e CYP19 foram identificada em todos os grupos, entretanto sem diferença significativa. A expressão do gene caspase 3 no grupo IN1FSH (P < 0,05) do que nos grupos IN10, IN100, IN10FSH e IN100FSH. Em conclusão a insulina no cultivo in vitro de fragmentos ovarianos de ovelhas, sozinha ou associada com FSH atua de forma dose-dependente na ativação folicular, preservando a morfologia, mas sem alterar o diâmetro folicular. Em alta concentração (10.000 ng/mL) a insulina possui efeito inibitório sobre o crescimento inicial dos folículos. Conclui-se, ainda, que a insulina pode reduzir a expressão do gene relacionado com a apoptose (caspase 3), quando em concentrações intermediárias (10 e 100 ng/mL) especialmente associados ao FSH.