Avaliando os efeitos das proteínas anticongelantes na viabilidade de embriões bovinos produzidos in vitro vitrificados - SILVA JÚNIOR, Rafael Artur da (2022)
A criopreservação de embriões é uma importante ferramenta que possibilita a logística de armazenamento e transferência de blastocistos de alto mérito genético. Existem na atualidade duas principais metodologias distintas de criopreservação, o congelamento lento e a vitrificação, desenvolvidas a fim de evitar crioinjúrias. A vitrificação é uma técnica de congelamento rápido, que transforma o líquido em estado vítreo, diminuindo os efeitos negativos da formação de cristais de gelo. Contudo, a técnica de vitrificação ainda pode causar danos referentes à formação dos cristais de gelo. Algumas proteínas foram identificadas como inibidoras de formação de gelo intracelular, denominadas de proteínas anticongelantes (antifreeze proteins - AFP). Estas proteínas têm ação na modificação da estrutura do cristal de gelo, diminuindo o ponto de congelamento e inibindo a atividade de recristalização. Com base no exposto este trabalho objetivou avaliar os efeitos crioprotetores da AFP extraída da gramínea Lolium perenne (LpAFP) e da AFP extraída da larva do besouro do Tenebrio molitor (TmAFP) na vitrificação de embriões bovinos. Para isto, blastocistos bovinos produzidos in vitro foram vitrificados utilizando o método cryotop em ambos experimentos. No primeiro experimento, durante o processo de vitrificação, os blastocistos foram aleatoriamente separados em dois grupos experimentais, sendo o grupo controle (GC) contendo 0 ng/mL de LpAFP e o grupo tratamento (GT) suplementado com 500 ng/mL de LpAFP. A vitrificação deu-se transferindo os blastocistos para a solução de equilíbrio: 7,5% de etilenoglicol (EG) e 7,5% de dimetil sulfóxido (DMSO) por 2 min, posteriormente para a solução de vitrificação: 15% EG, 15% dimetil sulfóxido (DMSO) e em seguida depositados na haste do cryotop e submersos em Nitrogênio líquido. O aquecimento foi realizado em três etapas com concentrações decrescentes de sacarose (1,0, 0,5 e 0,5 M de sacarose). Após o aquecimento, os blastocistos foram cultivados por 24 horas e analisados a taxa de sobrevivência (expansão e/ou eclosão), marcados com Hoechst para avaliação do número total de células e analisados em microscopia eletrônica de transmissão para avaliação ultraestrutural. No segundo experimento, os blastocistos produzidos in vitro foram aleatoriamente separados em três grupos experimentais e vitrificados com meio de estabilização e vitrificação suplementados com diferentes concentrações de TmAFP: 0 ng/mL; 500 ng/mL e 1.000 ng/mL. O processo de vitrificação e aquecimento se deu da mesma forma do primeiro experimento. Após 24 horas de cultivo pós aquecimento, foram analisadas a taxa de sobrevivência (expansão e/ou eclosão) e realizada análise ultraestrutural dos embriões expandidos. No experimento 1 os resultados mostraram que não houve diferença significativa na taxa de reexpansão 24 horas após aquecimento, entretanto houve variação (P < 0,05) na taxa de eclosão no GT. O número total de células 24 horas após o aquecimento foi significativamente maior no GT quando comparado ao GC (GT 114,87 ± 7,24 vs. GC 91,81 ± 4,94). A análise ultraestrutural demonstrou diminuição das lesões citoplasmáticas, principalmente nas mitocôndrias e reticulo endoplasmático rugoso no GT. No experimento dois, o grupo suplementado com 500 ng/mL de TmAFP (500TmAFP) apresentou maior taxa de sobrevivência quando comparado aos outros dois grupos, controle (0 ng/mL de TmAFP) e 1000TmAFP (1000 ng/mL de TmAFP), também foi observada maior taxa de expansão da blastocele no grupo 500TmAFP. Lesões ultraestruturais foram observadas em todos os embriões vitrificados, entretanto os embriões dos grupos 500TmAFP e 1000TmAFP apresentaram menos lesões citoplasmáticas quando comparadas ao grupo controle. Em conclusão, o experimento 1 demonstrou que a adição de 500 ng/mL de LpAFP durante a vitrificação de embriões bovinos produzidos in vitro se mostrou favorável na melhoria da sobrevivência e desenvolvimento dos blastocistos após o aquecimento. Em adição, o experimento 2 evidenciou que a suplementação de TmAFP pode mitigar as alterações celulares, as quais envolvem organelas e componentes celulares essenciais para o funcionamento adequado e viabilidade pós aquecimento de embriões bovinos produzidos in vitro vitrificados.