Seleção de eventos transformados de algodão resistente a insetos por meios moleculares e de imunodetecção - SILVA, Carliane Rebeca Coelho da (2014)
Várias instituições de ensino e pesquisa, em todo o mundo têm devotado esforços na descoberta de novas proteínas inseticidas e dos respectivos genes para o controle de pragas agrícolas. Trabalhos têm evidenciado o potencial de algumas moléculas no controle de insetos como as toxinas Bt do Bacillus thuringiensis, inibidores de proteases e de alfa-amilases e lectinas. Genes codificantes para essas proteínas têm sido estavelmente integrados ao genoma de plantas transgênicas conferindo-lhes resistência a pragas, como é o caso das culturas de tabaco, tomate, batata, milho e algodão Bt com resistência a lepidópteros que já são amplamente comercializadas em vários países. Vários estudos comprovam a economia e o benefício ecológico dessas cultivares no agronegócio internacional. Na lavoura algodoeira as pragas das ordens lepidóptera e coleóptera são os principais problemas econômicos em nível mundial. A Embrapa desenvolve pesquisas voltadas para o controle de pragas do algodoeiro com o intuito de reduzir os custos de produção, destes, 20 a 30% são para controle das pragas. Apesar dos importantes resultados obtidos até o momento o controle químico ainda tem sido o de melhor resposta embora mais oneroso no aspecto financeiro e mais agressivo no aspecto ambiental. O gene cry1Ia derivado da estirpe de Bacillus thuringiensis S1451 pode ser responsável por este tipo de controle. A atividade inseticida deste gene foi testada visando a análise da proteína recombinante para o bicudo do algodoeiro (Anthonomus grandis) e para a lagarta Spodoptera frugiperda. Indicando que este gene é bastante promissor para uso na área molecular visando obtenção de cultivar transgênica de algodão resistente a estas duas importantes pragas. Em um trabalho anterior esse gene foi inserido em três cultivares comerciais de algodão pela técnica de microinjeção via ovary drip. Nesse momento as cultivares receberam duas diferentes construções, compostas por um cassete linear mínimo mlc (≈ 3 Kb) e uma construção circular completa ccc (≈ 15 Kb), ambas contendo o gene cry1Ia. A integração do gene e expressão de proteína foram analisadas por PCR de DNA genômico, RT-PCR semi-quantitativo, Southern blot e ELISA. Mais de 1.800 transgenes foram testados e a integração do gene completo (1 cópia) foi detectada pelo ensaio de Southern blot e encontrada em apenas um único evento denominado T0 34 que foi derivado da cultivar BRS 293 no tratamento mlc, sugerindo uma tendência genótipo-dependente. A expressão da proteína Cry1Ia no evento T0 34, estimada por ELISA, foi semelhante a Bollgard comercial (Monsanto, EUA). A transmissão do transgene para progênies T1 foi demonstrada por análise de PCR e nenhum efeito pleiotrópico foi verificado nessas plantas que foram fenotipicamente normais, com flores férteis e produção de sementes abundantes. No aspecto entomológico larvas da lagarta militar foram utilizadas em bioensaios de alimentação com folhas dos eventos T0 resultantes da BRS 293. Essas mesmas plantas também foram analisadas quanto a expressão da proteína Cry1Ia, via ELISA. De um total de 48 plantas, apenas a T0 34 foi selecionada em ambos os ensaios, com taxa de mortalidade de 89% e elevada concentração da proteína toxica nas folhas. Botões florais desidratados dessa planta foram fornecidos a larvas do bicudo do algodoeiro para estudo de imunodetecção via microscopia ótica, utilizando-se tecidos do intestino médio do inseto. Verificou-se que a proteína presente nos botões florais se ligaram especificamente ao anticorpo utilizado demonstrando que esse evento é muito promissor para posteriores estudos de melhoramento visando resistência a duas importantes pragas da lavoura algodoeira.