Análises comparativas entre vitrificação em recipiente metálico e congelamen-to lento para criopreservação de tecido ovariano humano : aspectos morfológi-cos e resposta ao choque térmico - Galbinski, Sérgio (2020)
Introdução: A preservação da fertilidade feminina pré-tratamento oncológico visan-do possibilitar gestações futuras e a preservação da função ovariana é uma reali-dade. A criopreservação de embriões ou de oócitos é uma opção, mas posterga o tratamento oncológico por requerer estimulação ovariana e coleta de oócitos. Então, uma alternativa é a criopreservação de tecido ovariano por congelamento lento ou por vitrificação. A vitrificação apresenta como vantagens em relação ao congelamen-to lento a rapidez e não necessitar equipamento específico. Nosso grupo desenvol-veu uma cápsula metálica para vitrificação que permite um resfriamento rápido do material biológico e elimina a possibilidade de contato do tecido nela armazenado com o nitrogênio liquido (NL2) (Bos-Mikich et al., 2012; Aquino et al., 2014), uma po-tencial fonte de contaminação biológica. No entanto, independentemente da técnica de criopreservação utilizada, ela pode ser nociva aos tecidos e suas células, podendo afetar o seu funcionamento normal após o retorno á temperatura fisiológi-ca. Uma das estratégias desenvolvidas pelas células, ao longo da evolução, para se protegerem dos efeitos deletérios de diversos tipos de estresse não letais (como es-tresse térmico, químico, metabólico, entre outros) é o aumento da expressão das proteínas de choque térmico, particularmente, as de 70 kDa (HSP70). As HSP70 são utilizadas como marcadores universais da resposta celular ao estresse e já foram avaliadas em tecido ovariano de mamíferos pós criopreservação. Nosso laboratório desenvolveu uma técnica que possibilita avaliar a resposta ao choque térmico em diferentes células e tecidos (HSR, capacidade de aumentar a expressão de HSP70 frente ao desafio térmico) (Krause et al., 2015a). Esta técnica foi empregada no pre-sente trabalho, para testar como o tecido criopreservado responde a condições ad-versas após seu retorno a temperatura fisiológica. Objetivo: Comparar a efetividade da criopreservação de tecido ovariano humano pela técnica de vitrificação em recipi-ente metálico com a técnica de congelamento lento avaliando aspectos morfológicos e a resposta fisiológica ao choque térmico em termos de expressão das HSP70. Métodos: Laboratório de Fisiologia Celular e Laboratório de Embriologia e Histologia Comparadas do Instituto de Ciências Básicas da Saúde (ICBS) da UFRGS. Estudo experimental prospectivo pareado controlado com doze pacientes submetidas a videolaparoscopia ginecológica no Hospital Fêmina, no período de março a dezem-bro de 2018. Foi realizada biópsia superficial de tecido cortical ovariano e secciona-da em vários fragmentos menores medindo 2mm x 3mm x 1-2mm. Os fragmentos de cada paciente foram alocados em 3 condições: i) tecido ovariano fresco (tecido ime-diatamente avaliado), ii) tecido ovariano submetido a congelamento lento e iii) tecido ovariano submetido a vitrificação. Após reaquecimento ou descongelamento, todos os grupos foram avaliados morfologicamente. A avaliação fisiológica pela resposta ao choque térmico (HSR), foi realizada através da quantificação do imunoconteúdo de HSP70 a 37ºC e após elevação da temperatura para 42ºC por 2h. A quantificação de HSP70 foi realizada após 8 horas do choque térmico, por western blotting. O ta-manho da amostra foi calculado utilizando-se o programa WINPEPI, com poder de 80% e nível de significância de 5% e considerando a diferença esperada entre as proporções de 93% de folículos primordiais para vitrificação e 68% para conge-lamento lento. Resultados: O tecido ovariano fresco apresentou maior quantidade de folículos totais intactos quando comparado ao total de folículos nos grupos de tecido ovariano submetidos a congelamento lento e vitrificação (p=0,007). Quando comparadas as frequências de folículos intactos entre os grupos, houve diferença apenas para os folículos primordiais (p<0,001). A diferença foi encontrada entre o grupo fresco e os grupos de congelamento lento e vitrificação, que apresentaram menor porcentagem de folículos primordiais intactos, embora com números absolu-tos maiores no grupo de vitrificação. A HSR, avaliada pela expressão de HSP70, foi mais elevada no tecido ovariano fresco (p=0,001) e negativa após criopreservação. Não houve diferença da mediana de HSP70 entre as temperaturas nos grupos de congelamento lento e vitrificação (p=0,937). Conclusão: A criopreservação de te-cido ovariano, induzida por congelamento lento ou vitrificação, resulta, pelo menos nos tempos avaliados, na incapacidade das células/tecido ovariano de responder ao estresse térmico, embora tenha ocorrido uma melhor resposta fisiológica para o congelamento lento. A avaliação morfológica constatou que as duas técnicas apresentam comprometimento similar após a criopreservação, com vantagem para a vitrificação quando avaliada a quantidade de folículos primordiais intactos.