Geração de recursos genômicos em Eugenia uniflora L. (Myrtaceae) usando tecnologias de sequenciamento de nova geração e ferramentas bioinformáticas - Guzman, Frank (2014)
Pitanga (Eugenia uniflora L.) é uma árvore arbustiva com frutas semelhantes à cereja, que cresce em diferentes tipos de vegetação e ecossistemas como consequência da sua alta capacidade de adaptação a diferentes condições de solo e clima. Esta espécie é de particular interesse econômico devido às suas propriedades medicinais, que são atribuídas aos metabólitos especializados presentes em suas folhas e frutos. Entre os metabólitos, os terpenóides são os mais abundantes dos óleos essenciais que são encontrados nas folhas. A diversidade de terpenos observada em Myrtaceae é determinada pela atividade de diferentes membros das famílias das terpeno sintases e oxidosqualeno ciclases. Por outro lado, os miRNAs são pequenos RNAs endógenos que desempenham papéis regulatórios essenciais no crescimento das plantas, desenvolvimento e resposta ao estresse. Por esta razão, estudos extensivos de miRNAs foram realizados em plantas modelos e outras plantas de importância econômica nos últimos anos. Portanto, o objetivo deste estudo é gerar recursos genômicos para E. uniflora utilizando sequenciamento de nova geração e ferramentas de bioinformática para a identificação de miRNAs conservados e novos, bem como os genes envolvidos na sínteses dos terpenóides. No capítulo 3, bibliotecas de pequenos RNA e RNA-seq foram construídas a partir de folhas de pitanga para identificar miRNAs maduros e pre-miRNAs, respectivamente. De 14.489.131 leituras limpas de pequenos RNA, foram obtidos 1.852.722 sequências de miRNAs maduros que representam 45 famílias conservadas e que foram identificadas em outras espécies de plantas. Análises posteriores, usando contigs montados a partir do RNA-seq, permitiu a predição das estruturas secundárias de 42 pre-miRNAs: 25 conservados e 17 novos. Alvos potenciais foram previstos para os miRNAs maduros mais abundantes nos pre-miRNAs, identificados com base na homologia de sequências. Além disso, a expressão de 27 pre-miRNAs foi validada utilizando ensaios de RT-PCR em diferentes indivíduos de pitanga. Este estudo é o primeiro de identificação em grande escala de miRNAs e seus alvos potenciais de uma espécie da família Myrtaceae, e proporciona mais informação sobre a conservação evolutiva dos vias regulatórias dos miRNAs em plantas com destaques para os miRNAs específicos da pitanga. No capítulo 4, a biblioteca de RNA-seq sequenciada anteriormente foi utilizada para identificar os genes potencialmente envolvidos na via da biossíntese dos terpenos e diversidade dos terpenóides a partir da montagem de novo e a anotação do transcriptoma de E. uniflora. No total, foram identificados 72.742 unigenes com um comprimento médio de 1.048 pb. Destes, 43.631 e 36.289 unigenes foram anotadas com as bases de dados das proteínas não redundantes do NCBI e Swiss-Prot, respectivamente. A ontologia gênica categorizou as sequências em 53 grupos funcionais. A análise das vias metabólicas com KEGG revelou 8.625 unigenes designados a 141 vias metabólicas e 40 unigenes preditos como associados com a biossíntese de terpenóides. Por outro lado, foram identificados quatro genes putativos de terpeno sintases (TPS), de comprimento completo, envolvidos na biossíntese de monoterpenos e sesquiterpenos, e três genes putativos de oxidosqualeno ciclases (OSC), de comprimente completo, envolvidos na biossíntese de triterpenos. Além disso, a expressão destes genes foi validada em diferentes tecidos de E. uniflora. A futura caracterização bioquímica dos diferentes TPS e OSC descritos aqui determinará especificamente o tipo de terpenóide sintetizado em condições ambientais específicas. Os dados produzidos neste estudo servirão como referência para estudos genéticos sobre os mecanismos moleculares que são responsáveis pela composição química dos óleos essenciais em E. uniflora e os aspectos fisiológicos da capacidade de adaptação desta espécie a diferentes habitats.