Seleção e avaliação de genes de referência para estudos de expressão gênica em Eucalyptus - Bastolla, Fernanda Macedo (2007)
Um dos principais avanços da era pós-genômica consiste na possibilidade da análise da expressão global de genes pela tecnologia de microarranjos de DNA, a qual permite a investigação simultânea do perfil de transcrição de milhares de genes. Com os microarranjos, tornou-se possível comparar os padrões de expressão entre indivíduos de diferentes espécies, de diferentes órgãos/tecidos dentro de uma mesma espécie ou diferentes tecidos submetidos a várias situações e tratamentos e, ainda, analisar os genes de proteínas potencialmente reguladoras da transcrição, os fatores de transcrição. Uma etapa fundamental após a análise dos resultados dos microarranjos consiste na validação experimental dos dados de expressão gênica. Esta validação é realizada pela utilização da técnica de qRT-PCR (“Real Time Quantitative RT-PCR”) um método que, atualmente, apresenta maior sensibilidade e especificidade na análise de transcritos. A qRT-PCR necessita, entretanto, de normalização para uma leitura adequada dos dados. Essa normalização tornou-se bastante específica já que depende da disponibilidade de genes que apresentem transcritos com expressão uniforme em todas as células do organismo ou entre as espécies que estão sendo analisadas, bem como durante várias fases do desenvolvimento e sob diferentes condições ambientais. São os chamados genes-referência ou housekeeping. Entretanto, alguns trabalhos vêm constatando que os genes-referência utilizados na era prégenômica não apresentam expressão estável entre tecidos e genótipos e, por este motivo, não são adequados como controles em qRT-PCR. O objetivo desse trabalho foi investigar a estabilidade de expressão de genes constitutivos freqüentemente utilizados como controles internos em estudos de expressão gênica e selecionar novos genes-referência para Eucalyptus por meio de experimentos de qRT-PCR para a sua utilização na validação de experimentos de microarranjos do Projeto Genolyptus. Como resultados das análises de qRT-PCR, foi possível observar que para xilemas de E. globulus e xilemas e folhas maduras de E. grandis, os genes EuC12, At2g28390, EuC10, Histona H2B, Gliceraldeído- 3-fosfato-desidrogenase (GAPDH), EuC06 e EuC09 foram os que demonstraram, respectivamente, menor variação em suas expressões, caracterizando-se como constitutivos para estes tecidos. De acordo com os resultados encontrados nas análises com cDNAs derivados de folhas e xilemas de E. grandis, somente EuC12 e At2g28390 demonstraram invariabilidade de expressões entre os tecidos. Dois tradicionais genes constitutivos, Histona H2B e GAPDH, apresentaram uma variação considerável nas suas expressões entre os tecidos. Os genes selecionados, servirão como controles internos em todas as qRTPCRs subseqüentes nas avaliações de dados gerados pelos microarranjos de DNA para todos os demais genes sob análise no Projeto Genolyptus, e demais linhas de investigação de Eucalyptus. Paralelamente realizou-se, ainda, a seleção e análise de treze genes com expressão diferencial significativa entre tecidos vasculares das espécies de E. grandis e E. globulus. Estes foram selecionados com base nos resultados de microarranjos do Genolyptus e terão seus padrões de expressão analisados por qRT-PCR.