O papel de RNAs não-codificantes no desenvolvimento do diabetes mellitus e da doença renal do diabetes - Dieter, Cristine (2023)
Os RNAs não codificantes (ncRNAs) são um grande grupo de RNAs que não têm funções aparentes de codificação de proteínas, mas desempenham papéis importantes em diversos processos biológicos, incluindo a patogênese de doenças. Dentre os ncRNAs, duas classes vêm sendo amplamente estudadas, os microRNAs (miRNAs) e os RNAs nãocodificantes longos (lncRNAs). Os miRNAs são pequenos ncRNAs que regulam a expressão gênica. Mudanças na expressão de miRNAs foram observadas em diversas situações patológicas, incluindo no diabetes mellitus (DM) e suas complicações crônicas. Os estudos que relacionaram miRNAs circulantes, urinários ou renais com a doença renal do diabetes (DRD) sugerem que um perfil de miRNAs parece se alterar nas diferentes fases desta complicação. Entretanto, os resultados desses estudos ainda são inconclusivos. Sendo assim, estudos ainda são necessários para identificar um perfil alterado de expressão de miRNAs em pacientes com DRD. Os miRNAs encontrados em fluidos biológicos, tais como no sangue e na urina, são de especial interesse como potenciais biomarcadores, pois podem ser coletados facilmente e são estáveis sob diferentes condições de estocagem. Nesse sentido, os miRNAs urinários podem ser possíveis candidatos a biomarcadores da DRD, especialmente porque não são eliminados durante o processo de hemodiálise, não sofrem filtração glomerular e podem refletir mais diretamente alterações renais ao contrário de miRNAs circulantes no plasma ou soro, os quais podem estar marcando alterações em outros tecidos. Além disso, a coleta de urina aleatória é fácil de ser realizada, não necessita jejum e pode ser realizada a qualquer momento do dia. Dessa forma, realizou-se uma análise do miRNoma urinário (análise de todos os miRNAs maduros conhecidos) em pacientes com DRD [progressores vs. não-progressores para declínio rápido na taxa de filtração glomerular estimada (TFGe)] e em pacientes sem essa complicação com o objetivo de identificar um perfil de miRNAs urinários envolvidos no desenvolvimento e progressão da DRD em pacientes com DM tipo 1 (DM1). Para isso, realizamos uma fase de screening, onde foi feita a análise do miRNoma urinário em pacientes com DM1, sendo 6 sem DRD e 14 com DRD [divididos em progressores (n= 7) e não-progressores (n= 7) em relação à diminuição rápida na TFGe (declínio ≥ 3,5 mL/min/1,73m2/ano) durante o período de seguimento do estudo (média de 11.6  3.6 anos)]. O microarray foi realizado utilizando o GeneChip miRNA 4.0 arrays (Thermo Fisher Scientific). Como resultado, identificamos 79 miRNAs diferencialmente expressos entre os grupos. Entre esses, 63 diferiram entre progressores vs. pacientes com TFGe normal; 12 entre não-progressores vs. pacientes com TFGe normal; e 15 entre progressores vs. nãoprogressores. Análises de bioinformática mostraram que esses miRNAs estão envolvidos em vias associadas com o DM e a DRD. Após a análise do miRNoma, 2 miRNAs diferencialmente expressos entre os grupos da amostra screening foram selecionados para validação individual por real-time PCR. Isso foi feito em uma amostra independente de 46 pacientes com DM1: 18 sem DRD e 28 com DRD, também divididos entre progressores (n = 12) e não-progressores (n = 16) para diminuição rápida na TFGe. Confirmamos que o hsamiR- 30a-5p está aumentado em pacientes progressores vs. não-progressores e pacientes sem DRD. O hsa-miR-210-3p não teve seu resultado confirmado nesta amostra de validação. Além disso, realizamos uma segunda validação comparando os nossos dados do miRNoma com dados de um estudo de transcriptômica disponível no banco de dados público GEO (GSE121221). Esta análise confirmou que os hsa-miR-212-5p, hsa-miR-4484 e hsa-miR- 4487 apresentam níveis de expressão diminuídos em pacientes com DRD em comparação aos pacientes sem esta complicação. Como conclusão desse primeiro artigo, os hsa-miR- 30a-5p, hsa-miR-212-5p, hsa-miR-4484 e hsa-miR-4487 foram validados como potenciais biomarcadores para a progressão da DRD em pacientes com DM1. Além de investigar o papel dos miRNAs na DRD, também avaliamos o envolvimento de lncRNAs no desenvolvimento do DM e da DRD. Os lncRNAs são moléculas de RNA longas (> 200 nucleotídeos) que estruturalmente se assemelham ao mRNA, mas não codificam proteínas. Essa classe de RNA não codificante já foi associada com funções como de regulação da expressão gênica, controle do ciclo celular, transcrição, regulação do splicing, diferenciação celular, inativação do cromossomo X e imprinting gênico. Interessantemente, lncRNAs têm sido identificados em condições normais e patológicas, podendo funcionar como biomarcadores de diversas doenças, tais como o DM e suas complicações crônicas. Desta forma, visando proporcionar um melhor entendimento do papel do lncRNAs no desenvolvimento do DM, realizamos uma revisão sistemática e um estudo de caso-controle, seguido de análises de bioinformática, com o objetivo de encontrar lncRNAs associados ao DM. A revisão sistemática incluiu 53 estudos que investigaram a expressão de lncRNAs em pacientes com DM1 ou DM tipo 2 (DM2). Como resultado, encontramos 6 lncRNAs consistentemente desregulados em pacientes com DM (ANRIL, HOTAIR, MALAT1, MIAT, KCNQ1OT1 e MEG3) em comparação ao grupo controle. Análises de bioinformática demonstraram que esses lncRNAs estão envolvidos em vias relacionadas ao DM, tais como PI3K/Akt, MAPK, apoptose e FoxO. No estudo de caso-controle, investigamos a expressão dos lncRNAs MALAT1, MEG3, MIAT, PVT1 e TUG1 em células mononucleares de 27 pacientes com DM1 (casos) e 13 indivíduos saudáveis (controles). O grupo caso foi dividido em: 14 pacientes com <5 anos de diagnóstico de DM1 e 13 pacientes com ≥5 anos de diagnóstico. As expressões dos lncRNAs MALAT1 e TUG1 foram aumentadas em pacientes com <5 anos de DM1 em comparação ao grupo controle e pacientes com ≥5 anos de diagnóstico. A expressão de MEG3 também estava aumentada nos pacientes <5 anos de DM1 vs. controles. Interessantemente, os níveis de expressão de MALAT1 e TUG1 foram negativamente correlacionados com o tempo de DM1 e os níveis de MEG3 e TUG1 foram positivamente correlacionados com os valores de hemoglobina glicada. Além dos estudos em relação ao papel dos lncRNAs no contexto do DM, também avaliamos o envolvimento dessa classe de RNAs no desenvolvimento da DRD. Assim, em um primeiro estudo, avaliamos as expressões dos lncRNAs MALAT1 e TUG1 na urina de pacientes com DM1 categorizados em: 18 pacientes com DRD (casos) e 9 pacientes sem esta complicação (controles). A expressão do lncRNA MALAT1 foi aumentada na urina dos pacientes com DRD em comparação ao grupo controle. Análises de bioinformática mostraram que esses dois lncRNAs estão envolvidos em vias relacionadas ao DM e a DRD, tais como glicólise/gliconeogênese, PI3K-Akt, AMPK e a via do DM1. Num segundo estudo relacionado à associação de lncRNAs com DRD, comparamos as frequências dos polimorfismos rs3200401/MALAT1, rs1894720/MIAT, rs3931283/PVT1, rs11993333/PVT1, rs5749201/TUG1 e rs7158663/MEG3 entre 902 pacientes com DM2 com DRD (casos) e 394 pacientes com DM2 sem DRD (controles). Como resultado, o genótipo G/G do polimorfismo rs3931283/PVT1 foi associado com risco para DRD após ajuste para covariáveis. Em concordância, os pacientes com o genótipo G/G também apresentaram níveis maiores de excreção urinária de albumina (EUA) em comparação aos pacientes com o genótipo A/A. Interessantemente, pacientes com o genótipo G/G do polimorfismo rs7158663/MEG3 tiveram níveis diminuídos de creatinina e valores aumentados de TFGe comparado aos portadores do alelo A. Além disso, o alelo G deste polimorfismo no gene MEG3 foi associado com proteção para DRD severa. Em conclusão, os estudos incluídos nesta tese evidenciaram o papel de ncRNAs no DM e na DRD, demonstrando a contribuição de fatores epigenéticos no desenvolvimento dessas patologias. Um perfil de miRNAs associados com o desenvolvimento e progressão de DRD em pacientes com DM1 foi identificado. Além disso, nossos estudos indicam o envolvimento dos lncRNAs na patogênese do DM e da DRD, através de alterações nos seus níveis de expressão como também por meio da presença de polimorfismos genéticos nesses lncRNAs.