Caracterização funcional de três fatores de transcrição DOF de Eucalyptus grandis - Marques, Raíssa Volpatto (2018)
As proteínas Dof (ligação ao DNA com um dedo, do inglês, DNA binding with One Finger) compreendem uma família de fatores de transcrição exclusiva de plantas, caracterizadas pela presença de um domínio de ligação ao DNA semelhante ao domínio ‘dedo-de-zinco’. Estas proteínas estão associadas a diferentes processos biológicos vegetais como germinação, florescimento e outros. O objetivo principal do presente trabalho foi a caracterização funcional de três fatores de transcrição Dof de Eucalyptus grandis a fim de avaliar a função dos mesmos na biogênese do sistema vascular desta planta. Baseado em resultados prévios do nosso grupo, foram escolhidos três genes (EgD01698, EgD00607 e EgK00405) que apresentaram um perfil de expressão significativo em tecidos vasculares de caules de E. grandis e, também, alta homologia a genes Dof previamente caracterizados em tecidos vasculares de outros vegetais. As regiões codificadoras desses genes foram amplificadas por PCR e clonadas no vetor de entrada pENTR/D-TOPO (Invitrogen). Por recombinação, os genes foram transferidos para o vetor pH7WG2D (VIB) para expressão em Arabidopsis thaliana. Os genes Dof também foram clonados no vetor pGEX-4T-1 (GE Healthcare) para a expressão heteróloga em Escherichia coli Plantas de A. thaliana foram transformadas com os vetores binários pelo método de imersão floral e as sementes foram selecionadas com o antibiótico higromicina. Apenas duas plantas para o gene D00607 e duas para o gene K00405 foram obtidas. As plantas transgênicas estão atualmente sob cultivo para serem geradas linhagens homozigotas e, assim, caracterizadas molecularmente. Além disso, a localização subcelular foi verificada pela expressão transiente de Dof::GFP em folhas de Nicotiana benthamiana. A expressão de GFP foi detectada difusa no citoplasma e no núcleo. Entretanto, esses ensaios deverão ser repetidos para confirmação dos resultados. Em paralelo, células de E. coli BL21 (DE3) pT-GroE foram transformadas com os vetores pGEX-4T-1-D01698 e pGEX-4T-1-D00607. A expressão gênica foi induzida durante 20 h a 20oC com 1 mM IPTG. As proteínas foram detectadas na fração solúvel por SDS-PAGE e western blot e, posteriormente, purificadas por cromatografia de afinidade. A expressão bem sucedida das proteínas Dof em E. coli permitirá a produção dessas proteínas para futuros estudos de caracterização funcional.