Edição gênica em mucopolissacaridose tipo 1 utilizando o sistema CRISPR-Cas9 - Carvalho, Talita Giacomet de (2016)
A Mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é uma doença lisossômica de depósito (DLD) causada por mutações no gene da alfa-L-iduronidase (IDUA), enzima responsável pela degradação dos glicosaminoglicanos dermatan e heparan sulfato. Os dois tratamentos disponíveis, terapia de reposição enzimática e transplante de células tronco hematopoiéticas, têm limitações importantes. Os sistemas de edição gênica que foram desenvolvidos nos últimos anos parecem ser alternativas promissoras para este tipo de doença. Entre eles, o sistema CRISPR-Cas9 tem se destacado. Descrito como uma forma de sistema imune de bactérias, ele foi adaptado para editar locais precisos do genoma humano e de outros eucariotos. O objetivo geral desta tese foi utilizar o sistema CRISPR-Cas9 para a correção gênica em MPS I. No primeiro trabalho discutimos como a edição gênica pode ser aplicada no tratamento de diferentes DLD. Um dos principais fatores para que a modificação do DNA ocorra de forma eficiente é a entrega intracelular dos vetores em quantidade adequada. Para tanto, no segundo trabalho da tese, descrevemos um protocolo otimizado para transfecção de células tronco mesenquimais (CTM), que são células de difícil transfecção, com Lipofectamina® 3000. Utilizando CTM com poucas passagens, com aproximadamente 70 % de confluência e uma relação lipídeo/DNA de 3 μL/μg, obtivemos até 26 % de células transfectadas. O objetivo do terceiro trabalho da tese foi utilizar o sistema CRISPR-Cas9 para corrigir in vitro uma das mutações mais comuns em pacientes com MPS I, responsável pelo fenótipo grave da doença. Fibroblastos humanos homozigotos para p.W402X foram transfectados e analisados por até um mês após o tratamento. A atividade de IDUA nas células transfectadas aumentou significativamente, houve uma diminuição no número e tamanho dos lisossomos, e o sequenciamento de nova geração mostrou que um percentual das células tratadas apresentava a sequência normal do gene da IDUA, confirmando que a mutação patogênica foi corrigida. São apresentados ainda resultados de um trabalho em andamento em que CRISPR-Cas9 e um vetor doador foram utilizados para inserir o cDNA completo da Idua em CTM extraídas de camundongos MPS I. Após seleção das células modificadas, a atividade enzimática alta mostrou que a sequência foi corretamente inserida. Os estudos desta tese são uma prova de conceito de que a edição gênica com CRISPR-Cas9 pode ser usada para correção de mutações responsáveis pela MPS I e abre a possibilidade de uso desta tecnologia como uma nova abordagem terapêutica em doenças de depósito lisossômico.