Determinação do papel das proteínas NodD1 e NodD2 na ativação dos genes nod em Bradyrhizobium elkanii - Santos, Priscila Silveira dos (2018)
Na simbiose entre soja e bactérias diazotróficas ocorre o processo de Fixação Biológica de Nitrogênio (FBN) no nódulo. Nessa associação há uma comunicação constante, pois a liberação de exsudatos pela planta é percebida pela bactéria, que, então, produz lipo-quito-oligossacarídeos, chamados fatores Nod (FNs), moléculas de sinalização na nodulação. Esses FNs são produtos da atividade dos genes nod bacterianos. Os genes nod regulatórios codificam fatores de transcrição (FTs) responsáveis pela regulação dos genes nod estruturais, que codificam enzimas para a biossíntese dos FNs. Na região promotora dos genes nod atua o FT NodD, que se liga em sequências específicas conservadas, chamadas nod boxes. Essa comunicação abrange a regulação de vários genes, como os genes nod regulatórios nodD1 e nodD2 de Bradyrhizobium elkanii SEMIA 587. Bradyrhizobium elkanii são bactérias Gram-negativas, fixadoras de nitrogênio, usadas comercialmente para a produção de inoculantes na agricultura, devido à eficiência do processo de FBN na simbiose, o que justifica o interesse em torno dessa interação. No micro-organismo modelo Bradyrhizobium diazoefficiens USDA110, as proteínas NodD1 e NodD2, sintetizadas a partir dos genes nodD1 e nodD2, respectivamente, têm ações contrárias. Enquanto NodD1 age como um regulador transcricional positivo dos operons nod e regula a sua própria transcrição, NodD2 atua como um regulador negativo desses operons. Isso despertou o interesse de investigar o papel dessas proteínas em B. elkanii SEMIA 587, com a finalidade de testar se elas apresentam funções semelhantes àquelas demonstradas na estirpe padrão USDA110. Sendo assim, o objetivo do trabalho foi contribuir, através da aplicação de diferentes metodologias, para um melhor entendimento em relação à regulação dos genes nod em B. elkanii SEMIA 587. Para tanto, fragmentos de DNA contendo os genes nodD1 e nodD2 dessa bactéria foram clonados nos vetores pGEM e pGEX-4T2, para produção das proteínas recombinantes em Escherichia coli BL21, a fim de realizar experimentos de retardamento em gel para comprovar a ligação das proteínas NodD1 e NodD2 nos nod boxes identificados nas regiões reguladoras dos respectivos genes, bem como determinar a eficiência de cada ligação. A expressão de ambas as proteínas em E. coli foi visualizada em gel SDS-PAGE e as proteínas estão em fase de purificação. Clonagens posteriores realizadas usando o sistema Gateway® para inserção dos genes nodD1 e nodD2 no vetor de clonagem pENTR foram confirmadas por sequenciamento e recombinadas a dois vetores de levedura (pDEST-22 e pDEST-32). Esses procedimentos visam à execução de ensaios de duplo híbrido para verificar se as proteínas NodD1 e NodD2 são capazes de formar heterodímeros funcionais.