Desenvolvimento de métodos para o diagnóstico e diferenciação dos pestivírus - Canal, Cláudio Wageck (1997)
Os pestivírus compreendem agentes causais de doenças que têm um impacto econômico negativo para a agropecuária no mundo. O gênero Pestivirus compreende três espécies, nomeadas de acordo com o hospedeiro do qual eles foram isolados: o vírus da peste suína clássica (CSFV), o vírus da diarréia vírica dos bovínos (BVDV) e o vírus da doença da fronteira (BDV) dos ovínos. Esta tese teve como objetivos gerais o desenvolvimento e aplicação de testes para o diagnóstico e diferenciação dos pestivírus. O Artigo 1 descreveu o desenho e a utilização de um teste de transcrição reversa seguida de reação em cadeia pela polimerase (RT-PCR) que permitiu a detecção e a diferenciação do CSFV dos pestivírus de ruminantes através do tamanho do fragmento amplificado de DNA. Foi amplificado um segmento de DNA de 200 pares de bases (pb), quando se utilizou material proveniente de culturas celulares infectadas com dez linhagens do CSFV, e de 260 pb, quando se utilizou material proveniente de culturas celulares infectadas com 23 linhagens do BVDV e duas linhagens do BDV. A especificidade dos fragmentos amplificados foi confirmada por clivagem com enzimas de restrição. A sensibilidade foi igual ou um pouco menor do que o teste de peroxidase ligada à anticorpos. O Artigo 2 descreveu o estabelecimento de um teste de ELISA para a detecção de anticorpos anti-BVDV em soros de bovínos e a sua utilização na determinação da freqüência de bovínos soropositivos para o BVDV em 19 propriedades do Rio Grande do Sul e uma da Argentina. Também foi sequenciada a região 5' não traduzida do genoma de isolados da mesma região para a determinação dos tipos do BVDV presentes nesta área. O método de preparo do antígeno e o formato do ELISA descrito foram mais simples do que os descritos na literatura. O ELISA desenvolvido possui uma especificidade de 99,2% e uma sensibilidade de 97,5% quando comparado ao teste de soro neutralização (SN). A freqüência de 56% ± 15,1% dos animais com anticorpos antiBVDV foi similar aos valores encontrados na literatura para outros países. A análise dos genótipos indicou que existem BVDV de tipo I e de tipo II nesta região. O Anexo 1 descreveu a caracterização dos genes e a produção e purificação das proteínas Em\ E2 e NS3 da linhagem R1935/72 do BVDV no sistema de baculovírus, e sua utilização em testes preliminares de ELISA para detectar anticorpos anti-BVDV no soro de bovinos. Os testes de ELISA desenvolvidos com as proteínas recombinantes foram comparados com o que utiliza extratos de células infectadas como antígeno (Artigo 2). O seqüenciamento dos genes que codificam para as proteínas Erns, E2 e NS3 da linhagem R1935/72 demonstrou que esta linhagem é um BVDV de tipo I. Resultados preliminares em um ELISA indireto indicaram que as três proteínas recombinantes poderão ser utilizadas em testes para a detecção de anticorpos anti-BVDV em soros de bovinos.