Expressão e regulação da enzima desiodase tipo 3 em neoplasias mamárias - Goemann, Iuri Martin (2019)
O câncer de mama é uma doença altamente heterogênea, sendo que a identificação de biomarcadores que predigam o comportamento biológico do tumor contribuem para definição do prognóstico e estratégica terapêutica. Os hormônios tireoidianos (HT) são reguladores essenciais de diversos processos celulares, e alterações no status do HTs interferem na progressão tumoral através de virtualmente todos os marcos do câncer (“hallmarks of cancer”). Estudos clínicos têm associado os níveis de HTs a risco de desenvolvimento de câncer de mama, enquanto estudos in vitro têm demonstrado que os HTs influenciam a proliferação, apoptose e migração de células tumorais mamárias. A enzima desiodase tipo 3 (DIO3) é a principal enzima na inativação dos hormônios tireoidianos, e alterações na expressão dessa enzima tem sido descritas em diversas neoplasias humanas. Na primeira parte desta tese, o leitor encontrará um artigo de revisão sobre o papel dos hormônios tireoidianos no processo neoplásico e seus efeitos sobre cada hallmark do câncer. Na segunda parte, é apresentado um levantamento de dados originais e revisão sobre a expressão das desiodases - enzimas que ativam e inativam os hormônios tireoidianos – em diferentes neoplasias humanas, e seu potencial efeito sobre o processo tumoral. Na terceira parte, é apresentado o artigo original desta tese, com objetivos, metodologia, resultados e discussão dos mesmos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão e valor prognóstico da DIO3 em câncer de mama em humanos. Para isso foram utilizadas duas coortes retrospectivas de pacientes com câncer de mama. A expressão da enzima DIO3 foi avaliada através de técnica de imunohistoquímica em tecido de mama de 53 pacientes e quantificada através de H-Score em uma coorte primária. Subsequentemente, os resultados foram validados em uma segunda coorte de 1094 pacientes com câncer de mama utilizando-se dados de RNA sequencing (RNA-Seq) da base de dados The Cancer Genome Atlas (TCGA). Em ambas as populações, os dados de expressão foram correlacionados com dados clínico-patológicos dos pacientes, a significância prognóstica da expressão da enzima foi avaliada através de regressão de Cox e a avaliação de sobrevida foi realizada por método de Kaplan-Meier. O padrão de metilação de DNA da região genômica do gene DIO3 em mama foi analisado utilizando-se dados clínicos e de metilação de DNA de 890 pacientes provenientes da base de dados do TCGA. Adicionalmente, a regulação da enzima foi avaliada em linhagens celulares derivadas de câncer de mama (células MCF-7 e MDA-MB-231). 13 A expressão proteica de DIO3 foi encontrada em 35/39 (89.7%) das amostras de carcinoma ductal invasor, com H-Score médio de 104.9 ± 55, e em apenas uma amostra de três analisadas de carcinoma lobular invasor (H-Score=86). O mRNA do gene DIO3 está expresso em tecido mamário normal e tumoral, com expressão de mRNA reduzida em tumores em relação a tecido normal (logFC =-1.54, P ajustado <0.00001). A intensidade de expressão de DIO3 não se correlacionou com características clínico-patológicas dos pacientes na coorte primária, como tamanho tumoral, presença de metástase linfonodal ou à distância, positividade para receptor de estrógeno (RE), receptor de progesterona (RP) ou receptor epidérmico humano 2 do fator de crescimento (HER2). Entretanto, na mesma coorte, em análise univariada utilizando-se mortalidade como desfecho primário, a negatividade para expressão da DIO3 se associou a maior risco de morte (HR 4.29 [IC 95%, 1.24-14.7] P=0.021), sendo que pacientes com ausência de expressão de DIO3 tiveram menor sobrevida em relação à pacientes que expressavam DIO3 (73.3 meses [IC 95%, 41 a 105] vs. 122 meses [IC 95%, 109 a 135]; log-rank P=0.012). Validamos estes achados na segunda coorte (N=1094), onde a baixa expressão do gene DIO3 se correlacionou com maior tamanho tumoral (P=0.019) e negatividade para RE (P=0.022). Confirmando os achados da coorte primária, baixa expressão de DIO3 se associou a menor sobrevida global (HR 1.6 [IC 95% 1.18-2.26]; P=0.003) em modelo univariável e se manteve como preditor independente de prognóstico em modelo multiváriavel ajustado para idade, tamanho tumoral, presença de metástase linfonodal e à distância, status de RE e RP (HR 1.55 [IC 95% 1.07-2.24]; P=0.02). A sobrevida global em 5 anos foi de 90.4% (IC 95%, 86.4%-94.5%) no grupo com alta expressão de DIO3 e 77.4% (IC 95%, 71.3%-84.1%) no grupo com baixa expressão. A análise de metilação de DNA revelou que a região do gene DIO3 encontra-se hipermetilada em tecido tumoral relação ao tecido normal (p<0.0001), em especial os sítios CpGs localizados na região promotora do gene. A análise da regulação de DIO3 em linhagem celulares MCF-7 e MDA-MB-231 demonstrou indução do mRNA de DIO3 quando ambas as linhagens celulares foram submetidas a tratamento com 10 nM de triiodotironina (T3) por 24h. Além disso, ocorreu inibição dose-dependente do mRNA quando as células MCF-7 foram tratadas com dexametasona em doses de 10 e 100 nM, efeito que não se observou em células MDA-MB-231. A inibição da via mitogen-activated protein kinase (MAPK) com utilização do inibidor MEK-específico U0126 (10 uM) levou à redução de 50% na expressão de mRNA de DIO3 (P=0.004) em células MCF-7. 14 Em conclusão, nossos resultados indicam que a enzima DIO3 encontra-se expressa em tecido mamário normal e em câncer de mama. De modo interessante, a diminuição ou perda expressão de DIO3/DIO3 foi fator independente para menor sobrevida em duas populações distintas. A redução da expressão da DIO3 em câncer de mama pode ser explicada ao menos em parte por hipermetilação da região promotora do gene neste tipo tumoral. Em linhagem celular MCF-7, a enzima mantém suas características de regulação pré-transcricional por T3, dexametasona e modulação pela via da MAPK. Esses resultados apontam para a DIO3 como marcador prognóstico em câncer de mama, sendo a redução de sua expressão associada a pior sobrevida.