Caracterização de um modelo de inflamação em larvas de zebrafish : o papel do sistema purinérgico - Leite, Carlos Eduardo (2013)
Introdução: Entre os modelos utilizados para o estudo da inflamação está o que utiliza o cobre como agente inflamatório. O sistema purinérgico está envolvido na inflamação e em alguns tecidos pode ser afetado pela ação do cobre. Não obstante, nada se sabe sobre o comportamento do sistema purinérgico frente à inflamação induzida por este metal em larvas de zebrafish. Objetivo: Estabelecer e caracterizar um modelo de inflamação induzida pelo cobre em larvas de zebrafish e elucidar o envolvimento do sistema purinérgico. Métodos: Desenvolvemos uma metodologia para a quantificação de óxido nítrico (NO) por cromatografia líquida para a avaliação inicial dos efeitos do cobre sobre o estresse oxidativo. Posteriormente, realizamos curvas de mortalidade para o cobre e o lipopolissacarídeo (LPS) de Escherichia coli (E.coli). A metodologia foi utilizada para avaliar os níveis de NO após a indução da inflamação pelo cobre e a comparação com o outro agente inflamatório, bem como para quantificar os níveis basais desse íon em larvas de diferentes dias pós-fertilização. Na seguinte etapa, inserimos outros marcadores de estresse oxidativo e testamos as concentrações de 1, 10 e 25 µM de cobre durante um período de vinte e quatro horas. A concentração de 10 µM foi utilizada para indução da inflamação e a caracterização do sistema purinérgico. Os parâmetros avaliados foram estresse oxidativo, migração de neutrófilos, prostalandina E2 (PGE2), expressão gênica de mediadores inflamatórios, hidrólise extracelular de ATP e atividade das ecto-nucleotidases e da adenosina deaminase (ADA). As expressões gênicas das enzimas e dos receptores também foram avaliadas, bem como a absorção de cobre durante o período de exposição. Resultados: Por conseguinte, a metodologia utilizada para a determinação de NO foi validada com êxito e considerada adequada para a determinação do analito em alterações fisiológicas e patológicas em larvas de zebrafish. As curvas de mortalidade mostraram que as concentrações subletais foram de 10 µM para o cobre e 150 µg/ml para o LPS. As concentrações de NO em larvas de diferentes dias pós-fertilização apresentaram níveis crescentes de acordo com o estágio de desenvolvimento, ao passo que a exposição ao cobre e ao LPS induziram ao aumento do NO em comparação ao grupo controle nos tempos testados. Posteriormente, foi constatado que após a exposição ao cobre, ocorreu uma série de eventos inflamatórios que envolveram a PGE2 e a migração de neutrófilos para o foco inflamatório. A absorção do cobre foi tempo-dependente e coincidiu com o aumento do estresse oxidativo. As atividades da ecto-5´-nucleotidase (Ecto-5´-NT) e da ADA apresentaram redução, sendo que a nível molecular também foram constatadas alterações nas expressões gênicas destas enzimas. Os receptores de adenosina apresentaram aumento das suas expressões gênicas. Conclusão: O acúmulo do cobre absorvido durante o período de 24 horas induziu a inflamação e o estresse oxidativo. Dentro do sistema purinérgico o mais envolvido foi o adenosinérgico, que parece estar envolvido principalmente na resolução da inflamação. Esses resultados trazem novos avanços na caracterização da resposta inflamatória induzida pelo cobre em larvas de zebrafish, fornecendo novos conhecimentos e ferramentas para o estudo de mecanismos de ação e para a triagem de efeitos de novas terapias anti-inflamatórias.