Fitocistatinas em arroz (Oryza Sativa) e caracterização funcional da fitocistatina XII - Christoff, Ana Paula (2012)
Cistatinas são inibidores competitivos de proteases cisteínicas. Em plantas, as fitocistatinas, constituem uma família independente, caracterizada pela presença do motivo conservado LARFAV. Elas podem estar envolvidas em uma grande variedade de processos fisiológicos, desde o controle da proteólise endógena em órgãos reprodutivos e vegetativos, até a inibição de proteases extracelulares de herbívoros, parasitas e patógenos. Algumas fitocistatinas possuem uma extensão carboxi-terminal em sua sequência, com um motivo consenso SNSL importante para a inibição de legumaínas. Em arroz, existem doze genes distintos de fitocistatinas, sendo a fitocistatina XII (OcXII) a única com um domínio extra carboxi-terminal. Considera-se esta extensão extremamente importante, pois permitiria a atuação bifuncional deste inibidor de proteinase, simultaneamente inibindo dois tipos de proteases, papaínas e legumaínas. O objetivo principal que norteou o desenvolvimento deste trabalho foi identificar as doze fitocistatinas de arroz (Oryza sativa), caracterizando, principalmente, o gene da OcXII, de forma a analisar as prováveis implicações funcionais deste gene na planta. A caracterização da expressão dos doze genes codificadores das fitocistatinas revelou que os genes comumente mais expressos são OcI, OcIII e OcXII, sendo que OcXII destaca-se nas plantas em estádio final de maturação das sementes, em tecidos específicos de endosperma e células em cultura. Para germinação e crescimento de plântulas, é necessária uma redução da expressão de OcXII. O padrão evolutivo das fitocistatinas, em diversas plantas, sugere uma origem comum para estes genes, seguida de divergências e duplicações específicas em cada espécie. A OcXII é mantida em um grupo monofilético com as demais fitocistatinas com extensão C-terminal. Nos estudos funcionais sobre a fitocistatina XII de arroz, nove linhagens de plantas RNAi para o gene OcXII foram obtidas via transformação de calos de arroz (ssp. japonica, cv. Nipponbare). Quatro destas linhagens apresentaram nível de pelo menos 90% de silenciamento de OcXII, sem alteração na expressão gênica das demais fitocistatinas e legumaínas. Duas destas linhagens tiveram alterações fenotípicas com redução da viabilidade das sementes geradas. O silenciamento de OcXII e expressão de demais fitocistatinas manteve-se inalterado na geração T1, enquanto as legumaínas 1 e 3 sofreram alterações em pelo menos uma das linhagens. A transformação de plantas para estudos de localização celular com o promotor do gene OcXII, resultou em quatro linhagens transformadas, sendo que em uma delas a expressão do gene repórter gus, controlado pelo promotor OcXII, foi significativamente detectada nos calos em vias de regeneração de plantas. Também, pode ser verificado que a OcXII responde ao tratamento com ABA (ácido abscísico), tendo um aumento de expressão significativo após 4 horas, tanto em tecidos de folha quanto de raiz. Desta forma, a fitocistatina XII é um dos genes de fitocistatinas mais expressos durante todo o desenvolvimento das plantas de arroz, sendo o único gene com provável capacidade de inibir proteases cisteínicas do tipo legumaínas.