Determinação da atividade de hidrolases lisossômicas em sangue colhido em papel filtro, uma alternativa para triagem em populações de alto risco - Castilhos, Cristina Dickie de (2011)
As doenças lisossômicas de depósito (DLD) são erros inatos do metabolismo causadas pela deficiência de uma proteína, normalmente uma enzima, que resulta no depósito de lipídios nos lisossomos. Neste trabalho, nos propusemos a avaliar uma metodologia para a investigação bioquímica das DLDs. Amostras em papel filtro apresentam um menor volume de sangue coletado e uma maior facilidade quanto ao transporte e acondicionamento. Tivemos por objetivos estabelecer fatores pré-analíticos em amostras de sangue em papel filtro (SPF) tais como: efeito de anticoagulantes, temperatura de armazenamento e estabilidade ao longo do tempo para as enzimas b-galactosidase (b-gal), hexosaminidase total (Hex t), alfa-galactosidase (GLA), arilsulfatase B (ASB) e alfa-glicosidase (GAA). Também foi realizada a miniaturização e a correlação das metodologias em estudo. Descrevemos ainda nossa experiência no rastreamento das DLD em SPF em uma população de alto risco. Amostras de sangue de indivíduos normais (controles) foram coletadas em tubos com anticoagulantes EDTA, heparina, ou diretamente impregnados em papel filtro e armazenadas em diferentes temperaturas (-20, 4, 25 e 37ºC) e tempos (3, 10, 17 e 180 dias). Através da determinação da atividade enzimática em SPF por técnicas fluorométricas chegamos aos seguintes resultados: não houve diferença significativa entre os diferentes métodos de coleta do estudo para nenhuma das enzimas pesquisadas. Com relação ao efeito da temperatura e do tempo foi possível determinar que aos três dias de armazenamento, em todas as temperaturas estudadas e para todas as enzimas, as atividades permaneceram estáveis. A partir deste tempo cada enzima demonstrou um efeito diferente ao longo do tempo para as diversas temperaturas estudadas. Existem aquelas que não sofrem variação em sua atividade até 180 dias de armazenamento nas temperaturas estudadas (Hex t e GLA), aquelas que só vão diminuir sua atividade aos 180 dias em todas as temperaturas (ASB) ou somente a 37°C (b-gal) ou ainda aquela que diminui constantemente sua atividade a partir de 10 dias de armazenamento em todas as temperaturas (GAA). Se o objetivo for medir a atividade de todas as enzimas no mesmo papel filtro, então o melhor será armazenar o papel filtro por no máximo 10 dias em qualquer uma das temperaturas estudadas. Este tempo pode ser estendido até 180 dias em qualquer das temperaturas se formos analisar somente as atividades enzimáticas da Hex t, GLA e b-gal. O estudo de correlação das amostras de papel filtro de 1,2mm e 3mm de diâmetro para as enzimas alfagalactosidase, arilsulfatase B e alfa-glicosidase resultou nos coeficientes 0,994; 0,900 e 0,957; respectivamente. Isto demonstra que podemos diminuir o picote de papel sem perda da qualidade do ensaio. Por fim realizamos um rastreamento para as doenças de Pompe, Fabry, Mucopolissacaridose I e VI em 205 amostras de pacientes de alto risco, onde foi observado uma freqüência de 2,9% para estas DLDs após a utilização da metodologia pesquisada. Nossos resultados mostram a viabilidade na medida da atividade enzimática em SPF, o que facilita a coleta, envio e armazenamento das amostras para a triagem destas doenças lisossômicas.