Estudo das funções da proteína Kin3 de Saccharomyces cerevisiae na resposta a danos no DNA - Moura, Dinara Jaqueline (2010)
A resposta de células eucarióticas após exposição a estresse genotóxico é a ativação de uma intrincada rede de sensores, transdutores e efetores envolvidos em vias de reparação de DNA e controle de ciclo celular. Para garantir a fidelidade dessas vias regulatórias, existem mecanismos celulares evolutivamente conservados, chamados pontos de checagem, que monitoram a estrutura dos cromossomos, coordenando reparação de DNA e progressão do ciclo celular, controlando a capacidade da célula em parar o ciclo celular como resposta a danos no DNA, concedendo tempo para que ocorra a reparação. Os processos de reparação de danos no DNA são bem estabelecidos, porém, a sinalização para ativação de parada de ciclo celular na resposta a estas lesões é menos conhecida. A proteína Kin3 é uma serina treonina cinase de Saccharomyces cerevisiae estruturalmente relacionada à NIMA, um regulador mitótico descrito inicialmente no fungo Aspergillus nidulans, o qual está envolvido na regulação da progressão da fase G2/M e na organização de alguns eventos mitóticos. Como a maioria dos reguladores de ciclo celular é conservada, neste trabalho avaliou-se a função de Kin3p na resposta a danos no DNA. Nossos resultados demonstram que a deleção do gene KIN3 induz sensibilidade a cisplatina, doxorubicina, mustarda nitrogenada e MMS. Além disso, o mutante kin3 não apresenta uma parada de ciclo celular eficiente no ponto de checagem G2/M e uma diminuição da reparação das quebras no DNA após estes tratamentos, sugerindo que Kin3p possa estar envolvida no reconhecimento ou sinalização destas quebras. A expressão do gene KIN3 em resposta a estresse genotóxico está aumentada, assim como há um aumento da expressão da proteína codificada por este gene. O co-tratamento com cafeína, um inibidor das proteínas de sinalização de danos no DNA Mec1 e Tel1, induz um aumento da sensibilidade aos agentes genotóxicos no mutante kin3 e diminui a expressão do gene KIN3 na linhagem selvagem, sugerindo que a proteína Kin3 possa atuar em uma via de sinalização dependente de Mec1p/Tel1p. Na busca por esclarecimentos a respeito da via de atuação da proteína Kin3, avaliou-se a interação da mesma com as proteínas do complexo Mre11p/Rad50p/Xrs2p, já que previamente Mrellp tinha sido apontada como parceira molecular da proteína relacionada a NIMA de humanos Nek1. Nossos resultados de interação in vitro utilizando o sistema duplo híbrido, demonstraram que a proteína Kin3 interage com cada uma das proteínas do complexo MRX. Esta interação foi confirmada pela epistasia entre os mutantes kin3Δ e mrelΔl, rad50Δ ou xrs2Δ em ensaios de sensibilidade a cisplatina, mustarda nitrogenada e 8-MOP foto-ativado. A expressão do gene KIN3, que como mencionada anteriormente está aumentada na resposta a estresse genotóxico na linhagem selvagem, também está aumentada nos mutantes do complexo MRX, demonstrado que a ativação do gene KIN3 independe da formação do complexo MRX. O conjunto de dados apresentados nesta tese demonstra, pela primeira vez, o envolvimento da proteína Kin3 na resposta a agentes indutores de adutos no DNA, em uma via dependente de Tel1p/Mec1p, através da interação com o complexo MRX. Embora, o progresso no entendimento dos mecanismos de detecção, sinalização e reparação de danos no DNA tem sido grande, muitos detalhes moleculares ainda esperam por respostas e o estudo de novas proteínas pode ser importante para o entendimento destas lacunas.