Viabilidade de Mycoplasma hyopneumoniae e Mycoplasma hyorhinis em diferentes condições de cultivo - Beier, Laura Scherer (2017)
Micoplasmas estão difundidos pela natureza e são caracterizados por um genoma relativamente pequeno, baixo conteúdo GC e ausência de parede celular e de algumas rotas biossintéticas. Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína, capaz de colonizar o trato respiratório e seu crescimento in vitro, comparado com o de outros micoplasmas, é mais lento. Mycoplasma hyorhinis também é encontrado no trato respiratório de suínos. Devido à falta de algumas vias biossintéticas, micoplasmas são incapazes de sintetizar alguns nutrientes e componentes essenciais, sendo forçados a obtê-los do ambiente. Assim, um dos maiores empecilhos enfrentados na pesquisa e diagnóstico de micoplasma tem sido a dificuldade do cultivo in vitro. Portanto, o desenvolvimento de um meio de composição definida que sustente o crescimento celular serviria como uma ferramenta controladamente manipulável, permitindo a definição de suas vias metabólicas assim como análises genéticas. O objetivo do presente estudo foi analisar a viabilidade, taxa de crescimento e regulação gênica de M. hyopneumoniae e M. hyorhinis em diferentes meios de cultivo, assim como em diferentes condições de cultura. Neste trabalho, foi utilizado o meio Friis (1975) como meio complexo, e quatro meios definidos: (i) meio descrito para Mycoplasma pneumoniae por Yus et al. (2009); (ii) meio Yus sem adição de peptona; (iii) meio comercial CMRL e (iv) meio CMRL+ (complementado com lipídeos, aminoácidos e vitaminas). A viabilidade celular foi avaliada em todos os meios definidos e a taxa de crescimento de ambas as espécies nos cinco meios foi avaliada por citometria de fluxo. Os resultados demonstraram que a composição do meio influencia no crescimento da bactéria, uma vez que há diferença entre a concentração celular em cada meio testado. Entretanto, ambas as espécies apresentaram concentração celular semelhante em cada meio. Os resultados demonstram que, dentre os meios definidos testados, o meio CMRL+, desenvolvido no presente estudo, é o meio mais adequado, podendo ser considerado um meio de manutenção para estes microrganismos. Para a avaliação da regulação gênica através de qPCR, M. hyopneumoniae foi cultivado em meio Friis e CMRL+ sendo posteriormente submetido a condições de estresse (choque térmico e estresse oxidativo). Os resultados obtidos sugerem que M. hyopneumoniae altera seus níveis transcricionais mais rapidamente quando cultivado em meio CMRL+, provavelmente devido ao estresse duplo causado pela privação nutricional e estresse oxidativo ou choque térmico. Na condição de choque térmico, o tipo de regulação predominante diferiu entre os dois meios, enquanto que, quando submetido a estresse oxidativo, os genes apresentaram um padrão de regulação semelhante entre Friis e CMRL+. O meio de cultivo definido CMRL+ forneceu uma taxa de crescimento semelhante à do meio complexo Friis, e demonstrou presença de regulação gênica em M. hyopneumoniae em resposta à sua composição e às condições de estresse testadas. Portanto, este meio pode ser usado como uma ferramenta para o avanço da pesquisa com Mycoplasma.