Interações da α-sinucleína humana com vesículas extracelulares e ureases microbianas : efeitos dos agregados sobre a citotoxicidade observada in vitro - Meirelles, Evelin Furtado (2024)
O papel de microrganismos urease-positivos, como Proteus mirabilis e Helicobacter pylori, na progressão de doenças neurodegenerativas é pouco conhecido. Na Doença de Parkinson, corpos de Lewy, compostos de agregados de α-sinucleína (α-sin), levam à morte de neurônios dopaminérgicos na substância nigra pars compacta. Este estudo investigou a interação das ureases com a α-sin e a citotoxicidade dos agregados resultantes. A urease de P. mirabilis (PMU) foi purificada por cromatografias de gel filtração e troca iônica (Q Sepharose Fast Flow, Source 15QTM, e Superdex S200TM). A α- sin foi purificada por precipitação com HCl 9% e sulfato de amônio 50%, cromatografia em Source 15QTM. Nos ensaios de cinética de agregação, α-sin (50 ou 140 μM) foi incubada com PMU (6 nM) ou com vesículas extracelulares (OMVs) de H. pylori (Hp- OMVs, 50, 100 e 200 μg/mL) na presença de Thioflavina-T, sob agitação a 37 oC, por sete dias. O conteúdo de HPU das Hp-OMVs foi medido. Os agregados obtidos foram analisados por microscopia eletrônica de transmissão. Para avaliar a toxicidade, culturas de micróglia murina BV-2 foram tratadas com os incubados de 0 ou 7 dias, PMU (252 pM), α-sin (5040 nM), PMU + α-sin, LPS + α-sin (controle positivo), analisando-se viabilidade, citotoxicidade e apoptose com o kit ApoTox-GloTM. A produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) foi avaliada com a sonda CM-DFFDA, e a atividade metabólica celular, com o teste MTT. Os resultados mostraram que a PMU interferiu na oligomerização da α- sin, e que os agregados de α-sin formados na presença de PMU tem morfologias distintas. As Hp-OMVs não influenciaram a cinética da agregação ou a morfologia dos agregados de α-sin. Nos ensaios de toxicidade com o kit ApoTox-Glo, os incubados de 7 dias contendo α-sin sozinha, ou na presença de PMU e LPS, induziram um aparente aumento na viabilidade celular, sem alterações na citotoxicidade ou apoptose. Nas condições do ensaio, não houve aumento significativo na produção de EROs nas células tratadas. Já o teste MTT revelou que as células tratadas com os incubados de 7 dias tiveram importante redução na sobrevivência celular. Como conclusão, demonstramos que ocorre uma interação física entre PMU e a α-sin, impactando a cinética de agregação e a morfologia das fibrilas de α-sin. Estudos adicionais são necessários para esclarecer se as alterações induzidas por ureases na oligomerização e morfologia dos agregados de α-sin podem ter impacto nas alfa-sinucleinopatias, como a Doença de Parkinson.