Efeito da estimulação magnética estática em linhagem celular de neuroblastoma e neuroblastoma diferenciado - Medeiros, Helouise Richardt (2017)
Estimulação Magnética vem sendo utilizada no tratamento de várias patologias do sistema nervoso central, mas a compreensão de sua ação em nível celular precisa ser melhor investigada. Sendo assim, o objetivo principal desta dissertação foi estabelecer, em cultura celular, um método de Estimulação Magnética Estática (E- ME) e avaliar seu efeito em diferentes tipos celulares. Para tanto, foi desenvolvido um suporte de placa de cultura com ímãs NeFeB (neodímio-ferro-boro) com a forma cilíndrica de 12mm de diâmetro por 6mm de altura. Cada suporte apresenta seis ímãs espaçados, de modo que os campos magnéticos não interajam entre si. As células de neuroblastoma humano SH-SY5Y foram plaqueadas 1x106 células por poço e cultivadas em placas de 24 poços. A análise microscópica das placas demonstrou que as células adaptaram-se ao novo ambiente, demonstrando aderência e crescimento adequados à superfície da placa. Após este primeiro passo, as células SH-SY5Y foram estimuladas utilizando 0,1 T, 0,2 T e 0,3 T por 60 minutos, buscando determinar a melhor intensidade de EME. Após, este período de estimulação, para avaliar a viabilidade celular, foi realizado o ensaio de MTT (brometo de [3- (4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil tetrazolium) nos grupos de células estimuladas e não estimuladas. Não tendo sido observada diferença estatisticamente significativa entre os grupos avaliados. A partir da obtenção destes dados, foram definidos os parâmetros de intensidade e período de estimulação da EME. Os experimentos foram, então, realizados aplicando 24 horas de estimulação com intensidade de 0,3T em culturas de diferentes tipos celulares. Optamos por utilizar, além de células de neuroblastoma humano SH-SY5Y, outro tipo de células tumoral, células de melanoma vaginal; e células de neuroblastoma diferenciado em células neuronais e células mesenquimais derivadas de adipócitos. Com estas escolhas objetivamos determinar a resposta de diferentes tipos celulares a EME. Para tanto, cada tipo celular foi dividido em 4 grupos, 2 grupos não estimulados (controles) avaliadas imediatamente (CI) e 24h após o final do experimento (C24), e 2 grupos estimulados por 24h, que foram avaliados imediatamente (EI) e 24h após o final da exposição a EME (E24). Para verificar a resposta celular a EME foram avaliados parâmetros de toxicidade (MTT, PI (Iodeto de propídeo) e HO (Hoechst), de neuroplasticidade (expressão do gene do receptor de BDNF (PCR em tempo real)) e ciclo celular (citometria de fluxo). Os resultados obtidos demonstram que imediatamente após a EME, houve uma diminuição significativa na viabilidade celular das células SH-SY5Y indiferenciadas (Kruskal Wallis, P<0,05). Já no grupo 24h, não houve diferença estatisticamente significativa em nenhum dos gru 9 pos avaliados (Kruskal Wallis, P>0,05). Visto que, houve uma diminuição da viabili- dade celular nas células SH-SY5Y, imediatamente após a estimulação, na busca de encontrar o mecanismo de ação pelo qual estas células apresentavam uma diminui- ção celular, utilizamos as técnicas de PI e de HO para avaliar apoptose e necrose celular, respectivamente. Adicionalmente avaliamos o ciclo celular. Desta forma e, considerando que apenas as células de neuroblastoma humano SH-SY5Y apresen- taram diminuição significativa na viabilidade celular, somente neste tipo celular foi feito esta avaliação. Não foi encontrada diferença estatisticamente significativa entre os grupos. No entanto, a análise descritiva demonstrou que, 24h após o estímulo, as células SH-SY5Y não diferenciadas apresentaram uma redução de duplicação celular (Kruskal Wallis, P >0,05). Outro fator avaliado nas células SH-SY5Y diferenciadas e não diferenciadas, como parâmetro de neuroplasticidade, foi expressão do gene do receptor Trk-β. Não foi encontrada diferença significativa, no entanto na análise descritiva, as células SH-SY5Y não diferenciadas avaliadas 24h após a aplicação de EME, apresentaram um aumento na expressão deste gene, sugerindo um aumento da neuroplasticidade. Estes resultados demonstram um efeito de longa duração da EME, por pelo menos até 24h após o final da EME, corroborando com dados prévios de nosso grupo de pesquisa, utilizando modelos animais e ETCC (estimulação transcraniana por corrente contínua), outra técnica neuromodulatoria, que mostraram efeito por até 7 dias após o termino da tratamento. Interessantemente, não foram observadas diferenças na viabilidade celular nas de- mais culturas celulares analisadas. Estes resultados são muito relevantes, pois demonstram que, em relação aos parâmetros de viabilidade celular analisados, a EME é uma técnica segura no protocolo utilizado (24h de 0,3T de EME). Os dados desta dissertação demonstram que a EME apresenta diferentes efeitos em relação à toxicidade em células de tumores neuronais, tumores não neuronais e células com morfologia normal. A diminuição da viabilidade celular nas células SH-SY5Y indiferenciadas é um resultado surpreendente e favorável considerando ser linhagem celular tumoral. Desta forma estes resultados avaliados em conjunto sugerem que a EME é uma técnica segura que, em células normais não provocou alterações importantes nos parâmetros avaliados e em tumores de células não neuronais não alterou o crescimento celular. No entanto, ainda se faz necessário aumentar o numero amostral da avaliação das fases do ciclo celular a expressão do gene Trk-β, assim como mais estudos para avaliar outros parâmetros de toxicidade e também diferentes protocolos de estimulação celular utilizando a EME.