Hidrólise extracelular de nucleotídeos em Trichomonas vaginalis : caracterização bioquímica e localização enzimática - Tasca, Tiana (2005)
Trichomonas vaginalis é o protozoário flagelado causador da tricomonose, a doença sexualmente transmissível (DST) não virai mais comum no mundo. O T. vaginalis tem se destacado como um importante patógeno e está associado a graves complicações de saúde. Considerando o sério impacto da tricomonose na saúde pública, é importante estudar os aspectos bioquímicos do T. vaginalis que contribuem para infecção do hospedeiro e patogênese. Nucleotídeos extracelulares estão envolvidos em uma variedade de funções fisiológicas e patológicas, além de apresentarem propriedades citotóxicas. Os nucleotídeos extracelulares podem ser hidrolisados via ectonucleotidases, incluindo a família E-NTPDase (ectonucleosídeo trifosfato difosfoidrolase) e a ecto-5'-nucleotidase. Uma atividade de NTPDase1 foi previamente caracterizada em T. vaginalis. Nossos resultados mostraram a caracterização de uma ecto-5'-nucleotidase dependente de magnésio e cálcio e com atividade máxima em pH alcalino. Os valores de Km (Constante de Michaelis) situaram-se na faixa micromolar, com ampla especificidade a nucleosídeos monofosfatados. A atividade de ecto-5'-nucleotidase em T. vaginalis foi inibida pelo 5'-[α,ß-metileno]difosfato (AMPCP), inibidor específico da enzima em vertebrados. O metronidazol e o tinidazol apresentaram efeitos diversos na atividade da NTPDase1 e da ecto-5'nucleotidase de um isolado de T. vaginalis proveniente da American Type Culture Collection (ATCC) cultivado por longo período no laboratório e de um isolado clínico fresco. A hidrólise de ATP foi aumentada na presença de metronidazol no isolado ATCC. Por outro lado, ela foi inibida pelo tinidazol no isolado clínico fresco. O tratamento dos parasites na presença de metronidazol por 2h inibiu a hidrólise de ATP e ADP, enquanto o tratamento com tinidazol inibiu as atividades ATPásica e ADPásica somente no isolado clínico fresco. Os fármacos não produziram efeitos significativos na atividade da ecto-5'-nucleotidase de ambos os isolados de T. vaginalis testados. Os dados sugerem a função da NTPDase1 como moduladora da concentração de nucleotídeos extracelulares na presença de metronidazol e tinidazol, uma condição adversa para o parasito. Através de citoquímica enzimática, ambas as enzimas demonstraram ecto-localização, confirmando os mecanismos presentes no parasito capazes de realizar hidrólise extracelular de nucleotídeos. Diferentes concentrações de nucleotídeos da adenina e de adenosina não exerceram efeitos citolíticos nos trofozoítos. As atividades ATPásica e ADPásica apresentam-se mais elevadas em isolados clínicos frescos em comparação a isolados cultivados por longos períodos. A heterogeneidade foi demonstrada entre os diferentes isolados de T. vaginalis com relação à razão de hidrólise ATP:ADP. Alguns isolados apresentaram razão de hidrólise ATP:ADP igual a 1:0,8, característica de NTPDase1, enquanto outros apresentaram uma razão de hidrólise ATP:ADP de aproximadamente 2:1. Os isolados de T. vaginalis apresentaram diferenças dramáticas nos níveis de atividade da ecto-5'-nucleotidase e, surpreendentemente, alguns isolados apresentaram muito baixa ou nenhuma atividade. Diferentes condições de cultivo foram testadas e não apresentaram efeitos na elevação dos níveis da atividade enzimática. A ausência de atividade de hidrólise de AMP pelo T. vaginalis pode acarretar importantes conseqüências para ambos hospedeiro e parasito durante a infecção. O cultivo dos parasites em meio de cultura com e sem a adição de ferro não apresentou efeitos dramáticos na atividade da NTPDase dos diferentes isolados. Ao contrário, concentrações baixas e elevadas de ferro apresentaram decréscimo e aumento, respectivamente, na atividade da ecto-5'-nucleotidase daqueles isolados que apresentaram atividade sob condições normais de cultivo. Considerando os altos níveis de nucleotídeos púricos no sítio do T. vaginalis, a ausência de efeitos citolíticos nos parasites e a ecto-localização das enzimas envolvidas na hidrólise de nucleotídeos, sugere-se que a NTPDase1 e a ecto-5'-nucleotidase modulam as concentrações extracelulares de ATP, ADP e AMP. O produto final dessas reações, o nucleosídeo adenosina, é recaptado pelas vias de salvação.