Caracterização molecular em pacientes com Hemofilia B no Rio Grande Do Sul - Meireles, Mariana Rost (2017)
A hemofilia B (HB) (OMIM 306900) consiste em uma doença da coagulação de herança recessiva ligada ao X e afeta 1 a cada 30.000 nascimentos no sexo masculino. Essa doença genética é causada por mutações no gene do fator IX (F9) da coagulação. Existem cerca de 1095 mutações diferentes descritas em HB, com a prevalência de mutações do tipo missense(sentido trocado). Essas variantes levam a sangramentos, especialmente após injúrias vasculares ou cirurgias. A gravidade dos sangramentos está relacionada com a magnitude da deficiência do fator. A forma como as mutações interferem na função do FIX não é claramente determinada; diferentes aspectos poderiam estar envolvidos, como modificaçõesestruturais, perda de estabilidade e mudanças eletrostáticas. Este estudo tem o objetivo de (a) identificar mutações no gene F9 em pacientes com hemofilia B leve, moderada e grave, vivendo no sul do Brasil, estado do Rio Grande do Sul; (b) analisar a função das mutações na determinação da doença e fazer correlações entre o genótipo e o fenótipo, buscando regiões, domínios e aminoácidos que são determinantes para a função do FIX; e (c) investigar efeitos estruturais e eletrostáticos no FIX, de mutações previamente detectadas como causa da hemofilia B. Um total de 43 pacientes independentes diagnosticados com HB foi incluído no estudo. A atividade de coagulação do fator IX foi medidaatravés de ensaios de coagulação, e os pacientes foram classificados conforme os testes laboratoriais em leves (n=6), moderados (n=7) e graves (n=30). O DNA genômico foi extraído e todos os éxons do F9, regiões 5 ́UTR e 3 ́UTR, junções éxon-íntron e região promotora foram amplificados por PCR. Foi realizado o seqüenciamento direto para a detecção de mutações eas seqüências dos pacientes foram comparadas com a sequência do gene F9 normal utilizando a ferramenta CodonCodeAligner, implementado no software MEGA 5. As variações encontradas foram comparadas com aquelas presentes no Haemophilia B MutationDatabase (http://www.factorix.org/) e quando não estavam presentes nesse, nas ferramentas 1000 Genomes Browser e USCS Genome Browser, para verificar se eram polimorfismos. As mutações missense foram analisadas utilizando o BLASTP e UNIPROTKB/Swiss-ProtMammaliandatabase, comparando resíduos do FIX humano com seqüências do FIX ortólogas depositadas no mesmo banco de dados. Cinco algoritmos foram empregados para verificar o impacto das mutações missense encontradas na estrutura da proteína: PolyPhen-2 (Polymorphism Phenotyping-2), SiFT (Sorting Intolerant to Tolerant), HOPE (Have yOur Protein Explained), PROVEAN (Protein Variation Effect Analyzer), and Mutation Taster. Um total de 54 diferentes mutações missense foi usado em análises de estrutura, 18 delas oriundas do nosso estudo em pacientes do sul do Brasil e as outras 36descritas no Banco de Dados do Fator IX. Foram gerados modelos estruturais para cada mutação através de modelagem por homologia por meio do Phyre-2. Os modelos foram utilizados em análises de potencial eletrostático e em clusterizações por diferença eletrostática, com o objetivo de fazer uma comparação dos modelos mutantes com a estrutura e características físico-químicas do Fator IX normal. Os cálculos de potencial eletrostático (PE) foram realizados no sofware Delphi webserver e aplicados nos modelos por meio da interface Chimera. Para a clusterização das estruturas foi utilizada a ferramenta webPIPSA. Foram encontradas 31 variantes distintas entre as 43 famílias HB, incluindo 6 mutações que não estavam descritas no Banco de Dados do Fator IX. Nenhuma das variantes foi encontrada nos bancos de dados1000 Genomes Browser e UCSC Genome Browser. Entre as variantes encontradas existe a predominância de mutações de sentido trocado(23/31), seguida de sem sentido (4/31), processamento (2/31) e pequenas deleções (2/31). A maioria das mutações detectadas foi considerada como deletéria pelas predições dos algoritmos. Os tipos de mutações encontradas no Rio Grande do Sul apresentam uma distribuição que não se distancia daquelas observadas em pesquisas prévias. Considerando os modelos usados nas análises de clusterização, a análise de diferenças eletrostáticas mostrou que 31 dos 54 modelos analisadossão diferentes da estrutura selvagem. A distância eletrostática dessas 31 mutações em relação à estrutura normal varia conforme a mutação e poderia interferir com as funções do fator IX, causando HB.