Avaliação da proteína disulfeto isomerase A1 (PDIA1) como marcador para a qualidade seminal em garanhões - Linden, Liana de Salles van der (2017)
O período de puberdade, em equinos, define-se pela aparição de espermatozóides maduros no ejaculado de animais jovens, bem como a maturação das funções endócrinas. Os espermatozóides precisam passar por um processo de maturação no epidídimo. Para se obter marcadores moleculares que permitam estabelecer a fertilidade de um garanhão, é necessário um melhor conhecimento das proteínas presentes em espermatozóides imaturos e maduros, uma das quais é a PDI (proteína dissulfeto-isomerase). A PDI foi descrita também como importante marcador de fertilidade no plasma seminal e espermatozóides de diversas espécies. O objetivo deste trabalho foi identificar a presença da PDI no epidídimo equino durante a puberdade, e quantificá-la no fluido e espermatozóides epididimários. Visou verificar a presença da PDI no plasma seminal e espermatozóides ejaculados, em garanhões férteis e subférteis. Foram realizados dois experimentos: Experimento 1: utilizou-se 22 equinos Crioulos saudáveis, castrados e divididos em três grupos: G1: potros até 24 meses, G2: de 25-36 meses e G3: a partir de 36 meses. Imediatamente após a castração, foi efetuada a dissecação do epidídimo para a coleta de fluido epididimário, o qual foi separado dos espermatozoides por centrifugação a 800 g por 10minutos. O sobrenadante foi removido, e criopreservado a -196º C. Os espermatozóides foram ressuspendidos em PBS e armazenados a -196º C. Para a dosagem de proteína das amostras, utilizou-se o método de Kit BCA espectrofotômetro e a eletroforese em gel de poliacrilamida a 10% SDS- Page.Para imunodetecção das proteínas, efetuou-se a incubação do anticorpo primário específico por no mínimo, 6 horas a 4º C, e incubação com anticorpo secundário conjugado com peroxidase anti-igG de camundongo ou anti-IgG de rato. Para a visualização das bandas foi utilizado o Kit de ECL em filmes de raio-X, e as bandas quantificadas pela utilização do software livre ImageJ. A PDI foi identificada nos três grupos avaliados na análise proteômica do fluido , e espermatozoides epididimários, sendo sua quantidade inferior no G1 em relação aos grupos dois (2) e três (3). Em conclusão, a expressão da PDI nos espermatozóides e fluido epididimários de potros castrados cirurgicamente, aumenta conforme o animal atinge a maturidade sexual. Experimento 2- Utilizou-se 12 garanhões adultos que já haviam sido submetidos à pelo menos duas temporadas de monta na região da Campanha do Rio Grande do Sul, efetuando-se quatro (4) coletas de cada garanhão, fora da estação de monta, respeitando-se um intervalo de 48h entre coletas. Imediatamente após a coleta, analisou-se motilidade, vigor e concentração com auxílio de microscópio óptico e retirou-se uma alíquota de sêmen para avaliação das patologias espermáticas. A partir dos dados obtidos, os garanhões foram divididos em dois grupos: Grupo 1: motilidade não inferior a 70%, tendo-se uma média de 76,04±5,89% e histórico reprodutivo de temporadas anteriores com índice de prenhez mínimo por temporada de 80%. Grupo 2: motilidade igual ou inferior a 30%, com média de 11,83±11,21%, e histórico reprodutivo de temporadas anteriores de índices de prenhez inferiores a 35%. Efetuadas as análises, as mostras foram centrifugadas a 800 g por 10 minutos para separar o plasma seminal, de mesma forma que no Exp. 1. Os pellets passaram por ressuspensão em PBS gelado e posteriormente armazenados a -196º C. As amostras foram submetidas à dosagem das proteínas, para serem submetidas à eletroforese, utilizando-se géis de poliacrilamida a 10% SDS-Page.Para imunodetecção das proteínas, efetuou-se a incubação do anticorpo primário específico por no mínimo, 6 horas a 4º C, e incubação com anticorpo secundário conjugado com peroxidase anti-igG de camundongo ou anti-IgG de rato. Na visualização das bandas foi utilizado o Kit de ECL em filmes de raio-X, e as bandas foram quantificadas pela utilização do software livre Image J. Ao analisar a presença da PDI no plasma seminal dos garanhões, verificou-se sua expressão em ambos os grupos; porém não houve diferença de expressão da PDI entre eles(p˂0,05). Não houve também relação da PDI com motilidade, nem com a concentração espermática. Considerando os dados obtidos no presente experimento, não foi possível relacionar a PDI com qualidade espermática e assim considerá-la como um potencial marcador de fertilidade em equinos. São necessários mais estudos que possam envolver outros fatores moleculares inclusive as demais proteínas da família das PDIs.