Caracterização bioquímica de um protocolo de dissociação celular cerebral em peixe-zebra adulto para respirometria de alta resolucão - Moro, Luana (2019)
A mitocôndria é a principal organela responsável pela biossíntese de ATP nas células eucariontes por meio da fosforilação oxidativa. Esse processo é essencial para a manutenção da vida e alterações nessa via podem estar relacionadas a múltiplas disfunções. Atualmente, é possível medir o consumo celular de 2 e inferir o estado da fosforilação oxidativa por meio da técnica de respirometria de alta resolução. Apesar dos avanços na área, refinamentos nos protocolos, principalmente em ensaios que determinam a função mitocondrial utilizando células intactas, são necessários. Neste contexto, nosso objetivo foi caracterizar um método de dissociação tecidual de cérebro de peixes-zebra adulto, visando obter um dissociado com o maior número de células viáveis para uso na respirometria de alta resolução, bem como aplicá-lo frente a uma patologia, como a epilepsia. Foram utilizados 272 peixes-zebra adultos (5-6 meses de idade) na proporção de 50:50 machos:fêmeas (CEUA 33922). Os animais foram mortos e seus cérebros retirados. As amostras foram submetidas a quatro diferentes dissociações teciduais: dissociação mecânica com pasteur de vidro; dissociação mecânica com pistilo para eppendorf; dissociação enzimática com collagenase IV; e dissociação enzimática com tripsina. A viabilidade celular foi avaliada pela incorporação de azul de Tripan e pela atividade extracelular da enzima lactato desidrogenase (LDH). A respirometria de alta resolução foi realizada no equipamento Oroboros Oxygraph-2k através da medida do consumo de oxigênio por meio da adição de inibidores da cadeia transportadora de elétrons e titulação com desacoplador do potencial de membrana mitocondrial. A viabilidade celular medida pelo do método de azul de Tripan não apresentou diferença significativa para as dissociações mecânicas com pasteur de vidro e pistilo, porém o grupo homogeneizado com pasteur de vidro apresentou menor variabilidade nos dados. Através da avaliação da viabilidade celular dos diferentes protocolos de dissociação tecidual por método enzimático, as concentrações ótimas escolhidas para dissociação com collagenase IV e tripsina foram respectivamente, 0,1mg/mL e 0,01%; ambas com 10 minutos de incubação em banho-maria a 37º C. A avaliação da viabilidade celular através da atividade da enzima LDH não apresentou diferenças significativas entre os grupos testados. Com base nesses dados, utilizamos as dissociações mecânica com pasteur de vidro, collagenase IV ou tripsina para avaliar diversos parâmetros da função mitocondrial em células intactas. As dissociações enzimáticas apresentaram redução significativa na respiração de rotina (ROUTINE), na capacidade de fosforilação oxidativa (P/O2) e na respiração extramitocondrial (ROX) quando comparadas a dissociação com pasteur de vidro. Desta forma, escolhemos o método de dissociação mecânica como padrão para testar os parâmetros de respiração celular frente a um modelo de crises epilépticas prolongadas induzidas por ácido caínico. Um aumento significativo na capacidade respiratória de reserva (SRC) foi observado nos animais submetidos a crises epilépticas prolongadas quando comparados ao grupo controle. Como conclusão, de acordo com os resultados obtidos nesse trabalho, sugerimos que a avaliação da função mitocondrial em peixe-zebra adulto seja feita através do protocolo de dissociação mecânica com pasteur de vidro.