Análise de autofagia pela razão de fluorescências do marcador laranja de acridina uma ferramenta in silico para análise da evolução tumoral - Thomé, Marcos Paulo (2015)
A autofagia é um processo dinâmico de degradação de componentes celulares e está reconhecidamente envolvida em processos fisiológicos e patológicos. Por isso, uma melhor compreensão do processo autofágico é necessária para permitir sua manipulação em intervenções terapêuticas. Vários métodos têm sido desenvolvidos e amplamente utilizados para a determinação de diversos aspectos do processo autofágico, porém a falta de ensaios quantitativos rápidos pode prejudicar o desenvolvimento de terapias tendo a autofagia como alvo. O marcador laranja de acridina (AO) é um fluoróforo metacromático que fluoresce vermelho em organelas vesiculares ácidas (AVOs) e verde no restante da célula, sendo assim, a marcação com AO um método rápido e barato para detecção deste tipo de organelas, que aumentam durante a indução de autofagia. Entretanto, a especificidade da marcação com AO para quantificação de autofagia tem sido questionada. Desse modo, desenvolvemos uma nova abordagem para sua análise, considerando a razão de fluorescências verde e vermelha obtida a partir de citometria de fluxo. Com essa abordagem para análise de dados de marcação com AO foi possível detectar o aumento de autofagia induzido por rapamicina, e também o bloqueio pelo inibidor de acidificação lisossomal bafilomicina A1 bem como pelo silenciamento de genes da maquinaria molecular central que controlam a autofagia em diferentes etapas. Em comparação com a forma mais comum de analisar dados de AO, que considera somente a fluorescência vermelha, os resultados obtidos com a forma de análise proposta nesse trabalho tiveram uma melhor correlação com outros métodos bem estabelecidos para quantificação de autofagia, como conversão de LC3-I/II, degradação de SQSTM1/p62 e ensaio de formação de pontos de GFP-LC3. Essa nova maneira de analisar dados da marcação com AO pode permitir que este método fácil seja utilizado como uma abordagem inicial e objetiva para a avaliação de um passo tardio do processo autofágico em células individuais, complementando a utilização de outros métodos.