Tumor de Walker 256 : um estudo sobre características bioquímicas e expressão das ectonucleotidases - Buffon, Andreia (2006)
Nucleotídeos da adenina e adenosina estão envolvidos em uma variedade de processos patofisiológicos em diferentes células. O metabolismo extracelular destes nucleotídeos gerando nucleosídeos tem uma importante função regulatória no controle da homeostase, principalmente por regularem a agregação plaquetária, via receptores purinérgicos P2. Além disso, uma associação destes nucletídeos e nucleosídeo em processos neoplásicos tem sido sugerida. Enquanto ATP tem demonstrado exibir atividade anticâncer em uma grande variedade de células animais e humanas, estudos sugerem que adenosina possui ações promotoras de tumor. Muitos estudos também demonstram que antiinflamatórios não esteroidais, como o ácido acetil salicílico (AAS), podem proteger contra o desenvolvimento do câncer. As ações induzidas pela sinalização purinérgica são reguladas pelas ectonucleotidases, que incluem membros da família das ectonucleosídeo trifosfato difosfoidrolase (E-NTPDase) e ecto-nucleotídeo pirofosfatases/fosfodiesterases (E-NPPs), e ecto-5’-nucleotidase (ecto-5’N). Assim, no presente estudo nós investigamos o efeito do AAS na hidrólise do ATP até adenosina, bem como estudamos as características bioquímicas e expressão das ectonucleotidases no tumor de W256. A hidrólise dos nucleotídeos da adenina por plaquetas de ratos foi significativamente inibida por AAS, tanto para ATP quanto para ADP, mas não houve alteração na hidrólise do AMP. Em ratos submetidos ao tumor de W256, a hidrólise dos nucleotídeos da adenina em plaquetas e soro, obtidos 6, 10 e 15 dias após a indução subcutânea do tumor, foi significativamente reduzida. Em células tumorais de W256 (forma ascítica do tumor), a análise cinética indicou que várias ectonucleotidases estão envolvidas nessa cascata enzimática. Quanto às propriedades bioquímicas das E-NTPDases e ecto-5'-nucleotidase, para a hidrólise de ATP, ADP e AMP, o pH ótimo ficou entre 6,5-8,0 e também foi observado um requerimento de cátions divalentes (Mg2+ > Ca2+). Uma significativa inibição na hidrólise do ATP e ADP foi observada em presença de altas concentrações de azida sódica e de 0,5 mM de cloreto de gadolínio. Ainda, a análise de mRNA por PCR identificou a presença das NTPDases 2 e 5, e também da ecto-5'-nucleotidase nas células tumorais de W256. Com o objetivo de investigar as enzimas envolvidas no catabolismo dos nucleotídeos da adenina durante o crescimento do tumor, nós avaliamos a expressão destas enzimas bem como o padrão de degradação dos nucleotídeos extracelulares no tumor de W256, 6, 10 e 15 dias após a indução subcutânea. Os mRNAs de todas as ectonucleotidases estudadas (NTPDase 1, 2, 3 5 e 6 e ecto- 5’-nucleotidase), foram identificados por RT-PCR. A análise quantitativa, realizada por real-time PCR, apresentou como genes dominantes expressos durante o crescimento do tumor, as NTPDases 1 e 2 e ecto-5’-nucleotidase. O padrão de hidrólise do ATP extracelular determinado por HPLC, embora com alguma diferença entre os tempos estudados, se manteve similar. As células do tumor de W256 rapidamente hidrolisaram ATP levando à formação transitória de ADP, que foi completamente hidrolisado a AMP. A participação das NPPS 1, 2 e 3 na forma ascítica do tumor e VI durante o desenvolvimento do tumor subcutâneo de W256 também foi investigada. Nas duas formas do tumor o gene dominante foi o da enzima NPP3. Considerando que o ATP é reconhecido como um composto citotóxico em células tumorais, e que adenosina tem sido considerada promotora de tumor, é possível sugerir que, na circulação, a substancial redução na hidrólise dos nucleotídeos da adenina em plaquetas e soro após a indução do tumor pode representar um mecanismo de proteção contra o desenvolvimento tumoral. Por outro lado, nas células tumorais de W256, a elevada expressão de enzimas potencialmente envolvidas na hidrólise do ATP e do AMP, bem como a rápida hidrólise do ATP, pode representar um mecanismo que facilita a proliferação e invasão do tumor.