Clonagem, expressão e purificação de proteínas do plasma seminal bovino relacionadas à alta congelabilidade do sêmen - Bustamante Filho, Ivan Cunha (2010)
O uso da tecnologia de DNA recombinante abre portas para um estudo detalhado da estrutura e função de proteínas, e a produção de proteínas recombinantes em sistema procarioto apresenta várias vantagens. A presente tese propõe a expressão heteróloga das proteínas aSFP, proteína ácida do fluido seminal bovino de 14 kDa, e osteopontina (OPN) de 55 kDa, relacionadas à congelabilidade do sêmen. Foram construídas bibliotecas de cDNA de vesícula seminal, próstata e glândula bulbouretral. Oligonucleotideos iniciadores foram sintetizados baseados nas seqüências disponíveis no GenBank (aSFP: número de acesso NM_174616, OPN: número de acesso M66236). Os amplicons resultantes das reações de PCR foram clonados em pET23a(+). Os plasmidios pET-aSFP e pET-OPN foram transformados em linhagens eletrocompetentes de E. coli BL21, BL21 (DE3), BL21 Star, BL21 Codon Plus e BL21 pLysS. Para expressão das proteínas recombinantes foram testadas diferentes concentrações de indutor de expressão IPTG, e diferentes tempos e temperaturas de indução. A expressão recombinante foi avaliada por SDS-PAGE, usando como controle cultivo não induzido. Das cinco linhagens transformadas com pET-aSFP, somente E. coli BL21 pLysS induzida com 0,5 mM de IPTG por 3 horas a 37°C apresentou uma banda de aproximadamente 15 kDa, compatível com o tamanho esperado de aSFPr-6xHis. Por cromatografia de afinidade com metal imobilizado em condições desnaturantes foi possível um rendimento de purificação de 2,5mg/mL de aSFPr-6xHis por 10 mL de cultura bacteriana. Contudo, a expressão de OPNr-6xHis, também obtida com a linhagem de E. coli BL21 pLysS, foi de baixa eficiência, o que não permitiu sua purificação. A produção recombinante de proteínas do plasma seminal é uma das mais novas ferramentas para o estudo de suas funções. O aperfeiçoamento dos processos de expressão e purificação é fundamental no desenvolvimento desta biotecnologia, que possui grande potencial terapêutico e diagnóstico.