Caracterização funcional de And1 como potencial componente da via de sinalização de Ca2+/calcineurina em Cryptococcus neoformans - Marques, Bárbara Machado (2019)
Cryptococcus neoformans é um patógeno oportunista, principal causa de infecções fúngicas que acomentem pacientes imunocomprometidos. Esta levedura é capaz de colonizar o pulmão, disseminando-se para o tecido cerebral e causando um quadro de meningoencefalite criptococócica, frequentemente fatal. A sobrevivência de C. neoformans no hospedeiro é dependente do desenvolvimento de determinantes de virulência como crescimento a 37 °C, produção de cápsula polissacarídica e a produção de enzimas como urease e fosfolipase B1. Íons cálcio (Ca2+) são mensageiros intracelulares que participam da via de sinalização mediada por calcineurina, a qual é fundamental para a patogenicidade de C. neoformans. Transportadores vacuolares de Ca2+, como Pmc1, coordenam a regulação dos níveis de Ca2+ intracelulares. Foi demonstrado que Pmc1 é necessário para a virulência desta levedura, uma vez que linhagens contendo a deleção do gene PMC1 (pmc1Δ) foram avirulentas em modelo murino de infecção. Dados transcricionais prévios indicam que deleção de PMC1 desencadeia alterações na expressão de genes associados com mecanismos de disseminação cerebral e genes envolvidos com a via da calcineurina. No intuito de identificar possíveis reguladores ou alvos de calcineurina, genes cuja expressão é modulada pela deleção de PMC1 foram selecionados. A seleção foi restrita apenas à proteínas que continham assinatura de proteínas ligadoras de DNA. Análises por RT-qPCR demonstraram que o gene CNAG_03913 apresenta níveis de expressão significativamente aumentados em pmc1Δ na presença de FK506, sugerindo o envolvimento deste gene na via de sinalização de Ca2+/calcineurina. Análises in silico revelaram a presença do domínio AN1-like zinc finger, sendo então o referido gene denominado AND1 (AN1-like zinc finger containing domain). Para caracterizar funcionalmente o papel do gene AND1 na regulação da homeostase de Ca2+ em C. neoformans, linhagens mutante (and1Δ) e complementada (and1::AND1) foram construídas. Análises fenotípicas das linhagens mutantes indicaram possíveis alterações na parede celular. Células contendo a deleção de AND1 foram hipersensíveis ao crescimento em estresse de parede (Congo red) sob choque hiposmótico (meio YPD 0,5X), sugerindo uma relação com vias de manutenção da osmolaridade em C. neoformans. Além disto, análises de RT-qPCR indicaram diferenças significativas na expressão de genes codificadores de quitina sintases CHS3, CHS5 e CHS8, quitinase CHI22 e de PKC1 no mutante and1Δ, os quais podem ser correlacionados ao fenótipo de hipersensibilidade ao VIII agente estressor de parede celular Congo red. Estes dados sugerem um possível envolvimento de And1 com a regulação da parede celular de C. neoformans.