Revisão da patologia molecular e estratégia para a investigação de pacientes com suspeita clínica de esclerose tuberosa e diagnóstico molecular convencional inconclusivo - Garcia, Arthur Bandeira de Mello (2023)
A Esclerose Tuberosa (ET) é uma doença autossômica dominante com diversas manifestações clínicas afetando múltiplos tecidos. Embora o diagnóstico clínico desses distúrbios geralmente possa ser feito pelo fenótipo no nascimento ou durante o início da infância, o diagnóstico molecular é importante para aconselhamento genético. Também é particularmente importante nos casos de apresentação atípica, em que as características clínicas são insuficientes para o diagnóstico. Mais recentemente, com o advento da medicina personalizada, o diagnóstico molecular pode se tornar ainda mais importante para definir os candidatos a receberem tais intervenções. O diagnóstico molecular é geralmente realizado por sequenciamento de nova geração (do inglês next generation sequencing, NGS) e análise de variação do número de cópias (do inglês copy number variation, CNV), seguido da classificação das variantes detectadas usando diretrizes como as do American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) e/ou Sherloc. Esses critérios categorizam as variantes como: patogênicas, provavelmente patogênicas, provavelmente benignas, benignas e variantes de significado incerto (do inglês variant of uncertain significance, VUS). Uma proporção de pacientes com ET submetidos a diagnóstico molecular não tem variante patogênica identificada. Em cerca de 8% dos casos com suspeita ou diagnóstico clínico são identificadas VUS e em 10-40% destes pacientes não há variante patogênica identificada usando análise direta de DNA germinativo. Por outro lado, vários autores relatam que a frequência de variantes que afetam o processamento de RNA mensageiro pode chegar a 11- 16%, mas a frequência de tais alterações em pacientes brasileiros permanece desconhecida. Por esse motivo, o presente estudo tem como objetivo: Realizar uma análise detalhada das variantes identificadas em TSC1 e TSC2 constantes em uma base de dados moleculares pública e estabelecer uma metodologia para identificar variantes patogênicas causadoras de alteração ao nível do RNA em pacientes com diagnóstico clínico de esclerose tuberosa e resultado de diagnóstico molecular negativo ou inconclusivo. A revisão mostrou que as VUS são as variantes em TSC1/2 mais descritas no banco de dados ClinVar, com pouca informação sobre elas. Muitas dessas variantes apresentam conflitos na interpretação de significância clínica, ressaltando a importância de estudos funcionais; entretanto, foram identificados poucos estudos sobre essa temática na literatura (n=12). A maioria dessas variantes apresentam similaridade com variantes benignas. No entanto, variantes que apresentam mudança na matriz de leitura, sentido trocado e que estão em regiões canônicas de splicing tem um potencial de reclassificação como patogênicas. A falta de informação sobre elas dificulta a reclassificação no ClinVar e tem impacto direto para aconselhamento genético de pacientes acometidos com tais variantes, reforçando a necessidade de submeter o máximo de informações sobre variantes detectadas em banco de dados públicos. Com os dados disponíveis na base ClinVar, não foi possível identificar um hotspot de variantes patogênicas em ambos os genes. Para analisar o papel de VUS e identificar possíveis variantes intrônicas, foram recrutados quatro pacientes com suspeita clínica de esclerose tuberosa e com teste genético convencional negativo para análise de cDNA. Para isto, foram desenhados blocos de primers que abrangem a totalidade dos transcritos dos genes TSC1/2. Reações de amplificação por PCR de todos os primers TSC1/2 foram padronizados, todas as amplificações por PCR dos quatro pacientes com suspeita de TSC foram realizadas e, até o momento, nenhuma alteração de processamento (avaliada por diferenças de tamanho dos amplicons) foi identificada. O estabelecimento de um protocolo de triagem para variantes que resultam em processamento de RNA aberrante é de utilidade clínica significativa no cuidado de pacientes com suspeita de ET e seus familiares. Em última análise, nosso objetivo é contribuir para a implementação dessa metodologia como parte do diagnóstico molecular em casos negativos/VUS. Por fim, um melhor entendimento das variantes em TSC1/2 depositadas em um banco de dados público, assim como a padronização de uma metodologia para analisar papel de VUS e/ou identificação de possíveis variantes intrônicas em casos negativos de teste genético convencional podem resultar em maior compreensão da patogênese molecular da esclerose tuberosa e otimização do manejo clínico, em especial, aconselhamento genético de pacientes com a doença.