Análise abrangente de variantes de GNPTAB associadas à atividade deficiente da GlcNAc-1-fosfotransferase - Ludwig, Nataniel Floriano (2020)
As hidrolases lisossômicas são peptídeos sintetizados em ribossomos acoplados à membrana, e concomitantemente incorporados ao lúmen do retículo endoplasmático. Ainda nessa organela, essas proteínas são modificadas com oligossacarídeos padrão em resíduos de asparaginas contidos em sua estrutura primária. A geração de resíduos de manose-6-fosfato (M6P) nos oligossacarídeos presentes nas hidrolases lisossômicas garante o direcionamento destas aos compartimentos lisossomais. A primeira etapa da geração de M6P é realizada pela GlcNAc-1-fosfotransferase, que é residente da porção cis do complexo de Golgi, e realiza o reconhecimento das hidrolases e a transferência de um resíduo de GlcNAc-1-fosfato do doador UDP-GlcNAc para o resíduo de manose na posição 6 do oligossacarídeo presente na hidrolase. A GlcNAc-1-fosfotransferase é um complexo hexamérico formado por duas subunidades α, β e γ (α²β²γ²), onde as duas primeiras são codificadas pelo gene GNPTAB e a terceira pelo gene GNPTG. Variantes patogênicas identificadas no gene GNPTAB causam as doenças lisossômicas raras Mucolipidoses (ML) II e III alfa/beta, e variantes em GNPTG causam a ML III gama. Essas doenças são graves e caracterizadas por um extravasamento de hidrolases lisossômicas ao ambiente extracelular e, consequentemente, a ausência destas nos compartimentos lisossomais, o que ocasiona um acúmulo de macromoléculas não degradadas. Objetivos: 1) Caracterizar os mecanismos fisiopatológicos de variantes patogênicas de GNPTAB; 2) Caracterizar pacientes brasileiros com ML II e III alfa/beta em relação a variantes patogênicas em GNPTAB. Metodologia: Etapa 1 - estudo in vitro, no qual construtos contendo as variantes p.Asp76Gly, p.Ser385Leu, p.Glu389Lys, p.Asp408Asn, p.His956Tyr, p.Arg986Cys e p.Leu1168Glnfs*5 do gene GNPTAB foram geradas através de mutagênese sítio-dirigida, e transfectados por 24 horas em células HEK ou HeLa em condições normais de cultura celular. Extratos celulares foram avaliados através de deglicosilação enzimática, western blotting, imunofluorescência e microscopia confocal, e atividade enzimática residual. Etapa 2 - estudo transversal com amostragem por conveniência, no qual foi obtida amostra de DNA genômico ou RNA total de 18 pacientes não relacionados com ML II (n=10) ou III (n=8). O gene GNPTAB foi analisado através de sequenciamento de Sanger (n=17) e sequenciamento de nova geração (n=1). As variantes do tipo troca de sentido, ainda não descritas na literatura, foram pesquisadas em 200 alelos controles brasileiros. Etapa 3 - estudo retrospectivo que incluiu 32 pacientes brasileiros não relacionados (consanguinidade, n=6/32) com diagnóstico clínico 9 e genético de ML II/III alfa/beta. A frequência regional dos alelos alterados foi determinada. Resultados: Etapa 1 – as variantes p.Ser385Leu, p.Glu389Lys, p.Asp408Asn, p.His956Tyr e p.Arg986Cys são expressas, transportadas e clivadas por S1P de maneira comparável à proteína selvagem, contudo todos os mutantes apresentam atividade residual inferior a 5%. Já a proteína mutante p.Asp76Gly é modificada com estruturas de glicosilação, permanece retida no retículo endoplasmático e, por consequência, possui atividade residual indetectável. Etapa 2 - O genótipo foi determinado em 18 pacientes (ML II= 10, III alfa/beta= 8). Um total de 16 diferentes variantes foram encontradas, sendo nove ainda não descritas na literatura: r.86_116conNM_024312.5:19_49, c.227A>G, c.831delT, c.1154C>T, c.1763insA, c.1927delAATT, c.2034dup, c.2720_2721del e c.3333T>G. Somente as variantes c.3503_3504del (n=10/31), c.1208T>C(n=4/31), c.242G>T (n=3/31) e c.2249dup (n=2/31 alelos) foram recorrentes. Etapa 3 - Os pacientes eram originários de todas as regiões do Brasil (Sudeste n=14, Nordeste n=10, Sul n=4, Centro-oeste n=3, Norte n=1), sendo 6/32 consanguíneos. As variantes mais prevalentes foram a c.3503_3504del (n= 19, Nordeste n=9, Sudeste n=4, Centro-oeste n=4, Sul n=2), associada à forma grave da doença, e a c.1208T>C (n= 6, Nordeste n=3, Sudeste n=2, Centro-oeste n=1), associada à forma mais branda. A variante c.3503_3504del é a mais frequentemente encontrada nas regiões Centro-oeste, Nordeste e Sudeste do Brasil, enquanto a c.1196C>T é identificada em 42,8% dos alelos da região Sul. Conclusões: a caracterização do impacto funcional de variantes do tipo troca de sentido permitem concluir que os resíduos p.Glu389, p.Asp408, p.His956 e p.Arg986 são importantes para a função da catalítica da GlcNAc-1-fosfotransferase, enquanto que o aminoácido p.Asp76 pode estar envolvido no transporte da enzima ao complexo de Golgi. A análise genética dos pacientes brasileiros com ML II e III confirma a alta heterogeneidade genética e a alta frequência de variantes patogênicas privadas do gene GNPTAB, além de reiterar a variante c.3503_3504del como a predominantemente identificada nessa população. Sob a perspectiva de todos os pacientes diagnosticados com ML II/III no Brasil, é possível concluir que diferentes regiões apresentam frequências alélicas de variantes patogênicas específicas, o que pode ser explicado através da ocorrência de efeito fundador ou altas taxas de consanguinidade, ou uma combinação de ambas.