Caracterização de plantas transformadas de Urochloa brizantha sob déficit hídrico e validação de genes de referência para estresse salino - Silva, Fláive Loyze Baldassarini (2022)
Gramíneas forrageiras, dentre elas as do gênero Urochloa sp., possuem grande importância para as cadeias produtivas de carne e leite no Brasil, entretanto ainda há poucos estudos visando melhorar a tolerância à seca, considerando que com as mudanças climáticas previstas, há demanda por culturas resistentes a esse estresse. Plantas transgênicas com o gene P5CS de Vigna aconitifolia sob controle do promotor induzido por estresse AIPC, seriam uma alternativa adequada, considerando que a prolina exerce uma contribuição de extrema importância na mitigação da deficiência hídrica. O capítulo 1 dessa tese teve por objetivo avaliar plantas de Urochloa brizantha transformadas com a construção AIPC:P5CS quanto à bioquímica, fisiologia e caracterização molecular na resposta às condições de déficit hídrico. Para isso as plantas (controle e transformadas) foram conduzidas por aproximadamente 30 dias com irrigação diária por gotejamento, próximo à sua capacidade de campo, e após o déficit hídrico foi imposto por suspensão da água até as plantas atingirem valores de potencial hídrico de - 3,0 a -3,5 MPa, onde foram analisados conteúdo de prolina, MDA, clorofila, trocas gasosas foliares, biomassa e perfil transcricional do gene nativo UbP5CS e do transgene VaP5CS. A análise de três eventos de braquiária transformados com a construção AIPC:P5CS revelou que o evento E3 apresentou diferenças fisiológicas, bioquímicas e moleculares comparados aos outros eventos e ao controle. Além disso, esse evento exibiu diferença fenotípica dos demais. Mesmo apresentando essas diferenças, não houve constatação de maior tolerância ao déficit hídrico dos eventos em relação ao controle não transformado. O capítulo 2 refere-se a seleção de genes de referência para estresse salino em U. brizantha. A salinidade é um dos estresses abióticos mais importantes que afetam a produtividade das plantas. A expressão quantitativa de genes usando PCR em tempo real (RT-qPCR) é uma ferramenta que mensura as mudanças transcricionais que ocorrem em tecidos vegetais sob estresse. Para uma análise RT-qPCR válida, a normalização contra os genes de referência apropriados é essencial para a precisão dos dados. Apesar da importância do capim-braquiária (syn. Urochloa) como forrageira tropical, não há estudos sobre a estabilidade de genes de referência sob estresse salino nesta espécie. Este estudo teve como objetivo avaliar a estabilidade de sete genes candidatos de referência: Actin 12; fator de iniciação eucariótico 4A; fator de alongamento 1- α; tubulina α-5; tubulina β-6; enzima conjugadora de ubiquitina e glicose-6-fosfato desidrogenase para ensaios quantitativos de PCR em tempo real em U. brizantha sob estresse salino. O RNA total foi extraído de folhas e raízes de plantas cultivadas em sistema hidropônico contendo NaCl 200 mM durante 0, 6, 12 e 24 hrs para análise de RT-qPCR. Foi utilizado a ferramenta da web RefFinder para estabelecer uma classificação abrangente para a estabilidade do gene. Identificamos que eIF4a, α-Tub5 e Ubico foram os genes de referência mais adequados para amostras de folhas, enquanto eIF4a, Act12 e Ubico foram os genes mais estáveis nas raízes. Os genes mais e menos estáveis foram então usados para normalizar a expressão relativa de um gene transportador de Na+/H+ (NHX). A quantificação relativa desse gene variou de acordo com os controles internos (genes mais estáveis, menos estáveis), confirmando a escolha dos genes de referência.