Transformação genética de Urochloa brizantha para tolerância ao déficit hídrico e validação de genes normalizadores para estresses abióticos - Takamori, Luciana Midori (2018)
O capim braquiária é originário da África e pertence ao gênero Urochloa. Extensas áreas de pastagens são cultivadas com poucos cultivares devido a dificuldade no melhoramento genético dessa espécie. A espécie U. brizantha é tetraploide e apomítica e a mais cultivada no Brasil sendo utilizada tanto para alimentação animal quanto para a cobertura vegetal. A transformação genética é uma ferramenta importante para a introdução de genes com características de interesse agronômico. Ainda não existem cultivares transgênicos para as espécies do gênero Urochloa. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um protocolo para obtenção de plantas geneticamente modificadas de Urochloa por biobalística. Foram testados três tipos de explantes de Urochloa: epicótilo, calos de epicótilo e calos derivados de sementes pré inoculadas por cinco dias em meio MS contendo auxina 2,4-D ou picloram (1 mg L-1), as distâncias de 3, 6, 9 e 12 cm do microcarreador ao explante, e as concentrações de 30 e 60 mg.ml-1 de partículas. O vetor pANIC 6E e a pressão de 1100 psi foram utilizadas para avaliar a expressão transiente do gene uidA. A maior expressão do gene uidA foi observada quando calos induzidos a partir de sementes foram bombardeados na distância de seis cm e na concentração de 60 mg.ml-1 de partículas do ouro. Após a determinação dos melhores parâmetros, calos derivados de sementes foram bombardeados com o vetor pJS107 o qual contém o gene p5cs (Δ1 - pirrolina - 5 - carboxilato sintetase) e o gene bar. Calos bombardeados foram cultivados em meio seletivo contendo 2 mg L-1 de glufosinato de amônio. Foram regeneradas um total de 91 plântulas in vitro. As plantas foram aclimatizadas em casa-de-vegetação e submetidas a análise pela PCR para os genes inseridos. Um total de 79 plantas foram analisadas. Os fragmentos correspondentes aos gene bar (450 pb) e ao gene p5cs (580 pb) foram amplificados em 21 e 13 plantas, respectivamente. Somente 8 plantas apresentam os fragmentos correspondentes aos dois genes. A eficiência de transformação foi de 0,32%. Eventos transgênicos e planta controle (não transformada) foram submetidas ao déficit hídrico (-2,9 a -3,4 MPa) e a concentração de prolina nas folhas foi determinada. Os eventos transgênicos apresentaram até 1,9 vezes mais prolina que a planta controle em condições de estresse hídrico. O capítulo 2 dessa tese refere-se á validação dos genes normalizadores para estresses abióticos (frio, calor e seca) em U. Brizantha. Foi avaliada a estabilidade de nove genes de referência: Actina 12, fator de iniciação eucariótica 4A, fator de alongação-1 alfa, FTSH protease 4, fator auxiliar U2, succinol co-enzima A, tubulina alfa-5, tubulina beta-6, ubiquitina enzima conjugada. A expressão dos genes de refer^ncia foi medida por RTqPCR em amostra de folhas submetidas a 6, 12 e 24 h de frio e calor (10 e 45°C respectivamente) e ao déficit hídrico moderado (-0,5 a -0,7 Mpa), severo (-1,1 a -1,8 Mpa) e recuperadas após a irrigação. O programa RefFinder foi utilizado para classificar os genes de referência mais estáveis em cada estresse. O fator de alongação-1 alfa, a ubiquitina enzima conjugada ou fator de alongação-1 alfa e o fator de iniciação eucariótica 4A foram os genes mais estáveis para os estresses de calor, frio e seca, respectivamente. A expressão do gene da Rubisco foi normalizada contra o gene mais estável selecionado pelo RefFinder para cada estresse para validação.