Construção de um sistema de amplificação de sinal para riboreguladores - Franco, Rafael Augusto Lopes [UNESP] (2021)
Dengue e Zika são arbovírus do gênero Flavivirus e representam um risco de infecção para milhões de pessoas no mundo. Em 2019, o número de casos prováveis para essas doenças no Brasil aumentou 650% no caso da Dengue e 65% para Zika quando comparado ao ano anterior. Mesmo com a grande incidência o número de casos confirmados em laboratório (por sorologia ou detecção nucleica) é baixo, principalmente por detecção nucleica. Atualmente o diagnóstico preciso para esses arbovírus é feito por técnicas de ELISA e RT-PCR, esses procedimentos exigem uma estrutura laboratorial específica e a manipulação por profissionais tornando-os dispendiosos e morosos. Além disso, a estrutura laboratorial exigida inviabiliza o diagnóstico em regiões remotas do Brasil e também em outros países tropicais afetados. Este trabalho visou desenvolver circuitos sintéticos de DNA que sirvam para a identificação rápida e simples do RNA viral in vitro. Riboreguladores específicos, do tipo Toehold Switch, previamente desenvolvidos no grupo de pesquisa SynBio AQA denominados switch DENV10550(2) e switch ZIKV1440(2.6) capazes de detectar o RNA viral (RNA trigger) referente, respectivamente, aos vírus da Dengue e da Zika foram utilizados. Os riboreguladores foram empregados em 3 diferentes estratégias de amplificação de sinal: uma baseada na protease Mf-Lon, outra baseada na enzima T7 RNA polimerase e a terceira com base em uma integrase do tipo serina. A funcionalidade dos dispositivos foi avaliada por reações de transcrição e tradução in vitro na presença do RNA trigger sintético específico ou inespecífico. A ativação dos sistemas T7 RNApol foi medida pela atividade da proteína repórter luciferase. Nos dispositivos da protease Mf-Lon se utilizou a proteína fluorescente verde fusionada a cauda de degradação pdt#5 (específica à protease) para avaliar a resposta. Os ensaios com os sistemas Mf-Lon indicaram uma degradação baixa da proteína repórter, nota-se que a perda da fluorescência observada se deu, principalmente, por quenching da GFP após repetidos ciclos de excitação. Para o sistema amplificação baseado na integrase, devido a adversidades, não foi possível a construção da unidade de resposta. Construiu-se apenas os plasmídeos de detecção com a Int13 e com a Int9. Estes contêm o switch DENV10550(2) controlando o gene da integrase. Para o sistema T7 RNApol, a amplitude de ativação máxima foi obtida com o dispositivo separado em dois plasmídeos e empregando o switch DENV10550(2), atingiu-se uma amplitude de ativação 2,29 vezes maior na presença de 500 ng de RNA trigger específico (trigger DENV10550) em relação à reação com o trigger inespecífico. O dispositivo com o switch ZIKV1440(2.6) neste mesmo sistema apresentou uma amplitude de ativação menor quando empregado o RNA trigger específico (trigger ZIKV1440) em relação à resposta com o trigger inespecífico (trigger DENV10550), devido a esse fato reavaliou-se os switches utilizados no trabalho e constatou-se que o switch ZIKV1440(2.6) não é funcional. A resposta do dispositivo T7 RNApol com o switch DENV10550(2) mostra a funcionalidade e especificidade desta estratégia de sinalização, no entanto, a amplitude de ativação atingida foi pouco superior à alcançada no dispositivo com circuito direto de resposta.