Derivados anfifílicos de quitosana como agentes antimicrobianos: estudo da atividade e mecanismo de ação - Dias, Amanda Manchini [UNESP] (2017)
O presente trabalho descreve a síntese, caracterização e o estudo do mecanismo da atividade antimicrobiana de derivados anfifílicos de quitosana contra o fungo Aspergillus flavus. As quitosanas utilizadas nas sínteses foram obtidas pela desacetilação heterogênea de quitosana comercial. O derivado hidrofílico foi obtido pela reação de quitosana com cloreto de 2-cloro-N,N-dietilaminoetil (DEAE). O grau de substituição (GS) de grupos DEAE inseridos na cadeia polimérica foi determinado utilizando-se as técnicas de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN¹H) e Espectroscopia de absorção na região do Infravermelho (FTIV), obtendo-se 40% de substituição (QD 40% DEAE). Em seguida, a quitosana-DEAE foi degradada com nitrito de sódio para obtenção de polímeros com diferentes massas moleculares (Mw). As massas moleculares foram determinadas por Cromatografia de Permeação em Gel (GPC), e os valores obtidos foram 8 - 25 - 60 - 116 e 136 kDa respectivamente. Na sequência, as quitosanas de diferentes Mw foram alquiladas com dodecilaldeído seguido pela redução com borohidreto de sódio, obtendo-se derivados com ~20% de conteúdo hidrofóbico caracterizados por RMN¹H e FTIV. O comportamento em solução dos derivados anfifílicos foi estudado utilizando Espectroscopia de Fluorescência, e os resultados mostraram que em baixas concentrações os derivados de quitosana se auto-associam formando domínios hidrofóbicos. A agregação ocorre a partir da concentração de agregação crítica (CAC) que depende da massa molecular e do grau de substituição dos grupos hidrofóbicos presentes na estrutura polimérica. Os resultados dos ensaios microbiológicos mostram uma maior inibição do crescimento fúngico para os derivados de menor massa molecular (25 e 8 kDa) que pode estar relacionada a uma melhor interação entre o polímero e a membrana e/ou parede celular do A. flavus. Para investigar o mecanismo de interação da macromolécula com o fungo, realizou-se o estudo da interação dos diferentes polímeros anfifílicos com membranas modelo preparadas com os fosfolipídios L-α-fosfatidilcolina e L-α-fosfatidil-DL-glicerol, utilizando-se medidas de Espalhamento de Luz Dinâmico (DLS) e Potencial Zeta. Os resultados obtidos permitiram postular um modelo baseado na força de interação polímero-lipossoma, que depende principalmente da massa molecular e da carga superficial da vesícula. Para as vesículas zwiteriônicas a interação com a bicamada depende mais criticamente da massa molecular, visto que nos derivados anfifílicos de 8 e 25 kDa a interação polímero-lipossoma levou a formação de vesículas estabilizadas, ou seja revestidas por uma camada de quitosana que se deposita na superfície vesicular de forma gradativa, sem a formação de agregados. Para os derivados de maiores Mw (136, 116 e 60 kDa) as interações são mais intensas provocando a formação de agregados de vesículas em concentrações muito baixas (> 0,1 g L-1), porém o aumento abrupto do potencial zeta leva a desagregação das partículas originando lipossomas de ~300 nm de diâmetro. As imagens obtidas por Microscopia Eletrônica de Transmissão mostraram que o polímero atua na desestruturação da parede celular, pela associação com os polissacarídeos e proteínas da parede. Correlacionando-se as imagens obtidas pela microscopia confocal com as imagens de microscopia eletrônica de transmissão, pode se afirmar que a maior interação observada entre o polímero e os conídios se deve pela presença de maior concentração de proteínas hidrofóbicas na superfície dos mesmos, potencializando as interações entre o polímero e os constituintes da parede celular.