Influência do peróxido de hidrogênio na formação e virulência de biofilmes de Streptococcus mutans - Zenaro, Paula Pereira [UNESP] (2018)
O peróxido de hidrogênio (H2O2) é considerado uma das principais fontes endógenas de estresse oxidativo para bactérias orais. Contudo, o seu papel no processo de desenvolvimento da cárie dentária ainda não está completamente elucidado. O objetivo deste estudo in vitro foi gerar uma cepa de Streptococcus mutans tolerante ao H2O2, e avaliar a habilidade do H2O2 em afetar a formação e a virulência de biofilmes de S. mutans. Para gerar a cepa tolerante ao H2O2, a cepa de S. mutans UA159, foi reativada em placas de agar BHI e incubadas (48 horas, a 37°C e 5% de CO2). Duas a cinco colônias foram transferidas para tubos falcon contendo 2 mL de caldo BHI suplementado com 1% de glicose e incubadas por 18 horas, sob as mesmas condições. As culturas foram diluídas 1:20 em meio de cultura fresco, incubadas até atingirem a fase exponencial de crescimento, centrifugadas, lavadas, ressuspensas em glicina, e submetidas a tratamento com 80 mM de H2O2. Esses procedimentos foram repetidos por oito vezes, e as colônias sobreviventes foram consideradas tolerantes. Em seguida, para o crescimento do biofilme, foi usado um modelo de aderência ativa. Lamínulas de vidro estéreis, jateadas com óxido de alumínio, foram imersas em saliva filtrada para a formação da película adquirida. Posteriormente, foram imersas verticalmente em 2,8 mL de caldo BHI com 1% de sacarose (n=12 por grupo) inoculado com 106 UFC/mL da cepa controle (grupo GC) ou da cepa tolerante ao H2O2. Para a cepa tolerante ao H2O2, em um grupo (grupo GTcPH) foram acrescentados 80 mM de H2O2 ao meio de cultura e, no outro (grupo GTsPH), os micro-organismos cresceram em meio de cultura semelhante ao do grupo GC. As placas foram incubadas a 37°C com 5% de CO2 por 5 dias e o meio de cultura foi renovado diariamente. Em seguida, a suspensão bacteriana obtida dos biofilmes foi usada para a contagem de micro-organismos, dosagem de polissacarídeos insolúveis em água e quantificação de proteína total. O meio de cultura foi usado para avaliação do pH e da concentração de ácido lático. Os dados de contagem de micro-organismos do biofilme, os valores de pH do meio e a concentração de ácido lático foram analisados pelo teste ANOVA com correção de Welch, seguido do pós teste de Games-Howell para dados heterocedásticos. Para o peso seco do biofilme, concentração de proteínas e quantificação de polissacarídeos extracelulares insolúveis em água, foram analisados apenas os grupos GC e GTsPH. No grupo GTcPH o biofilme formado foi insuficiente para a realização dessas análises. A distribuição dos dados foi normal e houve homogeneidade de variâncias, sendo aplicado o teste t de Student. O nível de significância estabelecido para todos os testes foi de 5%. A contagem de UFC no biofilme foi significativamente menor apenas no grupo GTcPH (p<0,001). Este grupo mostrou valores de pH significativamente maiores que os grupos GC e GTsPH (p<0,001). A concentração de ácido lático foi maior em GC, seguido pelos grupos GTsPH e GTcPH, tendo o último produzido a menor quantidade do ácido lático (p<0,001). Não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos GC e GTsPH para peso seco do biofilme e concentração de proteínas (p≥0,051). A concentração de polissacarídeos extracelulares insolúveis em água foi significativamente maior no grupo GC em relação ao grupo GTsPH (p=0,040). Baseado nos resultados obtidos, pode-se concluir que a cepa tolerante ao H2O2 apresentou uma diminuição na expressão de fatores de virulência quando cultivada tanto na presença quanto na ausência do H2O2.