Desenvolvimento de sistema de controle de fluxo de carbono em vias metabólicas sintéticas de levedura - Lelis, Maria Cecília de Souza (2022)
O limoneno é um monoterpeno cíclico amplamente utilizado por seu aroma agradável na indústria de cosméticos, sendo também utilizado nas indústrias de biomateriais e biocombustíveis por ser um precursor químico nestes ramos. Assim, a produção em microrganismos surge como uma opção rápida e prática para atender a demanda comercial. Entretanto, a rota metabólica dos terpenoides compete por recursos com a maquinaria celular. Até o momento, as linhagens de Saccharomyces cerevisiae que foram construídas visando o aumento da produção de terpenos, sofrem com o acúmulo de isopentanil pirofosfato (IPP), um dos precursores da rota dos isoprenoides, que é tóxico para a célula em altas concentrações. Através da reconstrução dos genes IDI1, ERG20W e ClLS, buscamos aumentar o fluxo de carbono pela via de biossíntese de monoterpenos e reduzir a disponibilidade citoplasmática de IPP, visando direcionar o fluxo de carbono para a produção de limoneno pela canalização de substrato, que consiste na formação de complexos proteicos formados por enzimas que catalisam reações subsequentes em uma via metabólica. Assim, buscou-se clonar os genes das enzimas da via metabólica fusionados a synzips, que consistem em peptídeos sintéticos capazes de formar heterodímeros. Desta forma, sondamos três configurações para a canalização de substrato, heterodímero linear, heterotrímero linear e heterotetrâmero em anel, para comparar a capacidade de produção de limoneno entre as linhagens. Para as etapas de clonagem, utilizamos o plasmídeo pYES2, que possui origem de replicação para Escherichia coli e S. cerevisiae. As etapas consistiram em ligar ao plasmídeo os genes CILS-synzip21 e ERG20w-synzip19, para formar o heterodímero, IDI1-synzip18, ClLS-synzip21 e ERG20w-synzip19, para formar o heterotrímero, e ligar ClLS-synzip20 aos genes anteriores, para formar o heterotetrâmero.