Aplicação de um sistema sintético de controle da expressão gênica para a produção de vitamina B2 em Bacillus subtilis - Amorim, Laura Araujo da Silva (2021)
A riboflavina é uma vitamina solúvel em água que possui papel essencial no crescimento e desenvolvimento celular, sua produção anual total é de aproximadamente 9000 toneladas, sendo um bioprocesso rentável. As cepas industriais utilizadas para a produção de riboflavina foram obtidas através de técnicas de mutagênese, porém as mesmas apresentam limitações referentes ao crescimento celular e a produtividade da biomolécula. Com o avanço no conhecimento sobre a diversidade, estrutura e função dos RNAs não codificantes houve a possibilidade da sua utilização na regulação de diversos metabolismos microbianos. Sendo o metabolismo de purinas e riboflavina em Bacillus subtilis controlado por mecanismo de regulação do término prematuro da transcrição, os riboswitches, o uso de RNAs como mecanismo regulador se torna uma possível ferramenta para criação de cepas industriais superprodutoras destes compostos. Sendo assim, ambicionou-se a criação de cinco sRNAs sintéticos para avaliação da interferência dos mesmos na regulação negativa causada pelos riboswitches do metabolismo de purinas e riboflavina em B. subtilis. Foram desenvolvidas, então, linhagens de B. subtilis contendo um sRNA, sendo específico para cada riboswitch presente no metabolismo de purinas e na produção de riboflavina, além de um sRNA capaz de parear com o RBS do mRNA contendo o gene purR. Além desses sRNAs serem introduzidos no cromossomo de B. subtilis individualmente, foram introduzidos os dois sRNAs com os resultados mais promissores (ribDG e purR) e também um operon contendo todos os sRNAs, estando esses conjugados a diferentes ribozimas, em um transcrito único. Dessa forma, observou-se que as linhagens desenvolvidas apresentaram o crescimento esperado indicando que a inserção não promoveu estresse metabólico para a célula, em alguns casos até melhoraram a densidade populacional em relação à linhagem parental. Porém, ao analisar a produção de riboflavina quantificada via HPLC, conclui-se que as cepas contendo os sRNAs xpt, purR e ribDG apresentaram aumento da produção em 48%, 34% e 30%, respectivamente. Essas três linhagens foram cultivadas aumentando a escala para frasco de Erlenmeyer, onde observou-se que os sRNAs ribDG e purR, tiveram cerca de 50% maior produção de riboflavina que o controle. Dessa forma construiu-se um operon composto pelos sRNAs purR e ribDG e a linhagem contendo este operon no genoma aumentou 10% a produção de riboflavina em comparação com B. subtilis com um sRNA apenas, representando aumento de 65% em comparação com a linhagem parental. Em relação ao sistema com todos os sRNAs desenvolvidos em um transcrito único, este foi introduzido no cromossomo de três linhagens diferentes de B. subtilis. Essas linhagens também não apresentaram problemas no crescimento, sendo que a produção de riboflavina em escala de Erlenmeyer alcançou níveis superiores em comparação ao seu controle em 44% para a cepa de B. subtilis superprodutor de riboflavina e 65% para a cepa de B. subtilis RFAi. Sendo assim, ao utilizar sRNAs sintéticos para desenvolver cepas produtoras de riboflavina aprimoradas, provamos que os sRNAs são adequados para a regulação da expressão em B. subtilis. A facilidade de projetar e construir, e o fato de que o sRNA direcionado ao riboswitch funciona com uma única cópia do genoma, o tornam uma ferramenta atraente para a engenharia de cepas produtoras de metabólitos industriais. Além disso comprovamos a interferência na regulação gênica de riboswitches no metabolismo de purinas e riboflavina em B. subtilis resultando em linhagens aprimorada para produção desses compostos de interesse industrial.