Caracterização da proteina LaRbp38: mapeamento do domínio de interação com ácidos nucléicos e identificação de possíveis proteínas parceiras - Perez, Arina Marina [UNESP] (2009)
O presente trabalho teve por objetivo mapear os domínios de interação da proteína LaRbp38 (RNA binding protein 38 KD) de Leishmania amazonensis com ácidos nucléicos e a identificação de proteínas parceiras que formassem possíveis complexos com ela nos telômeros do parasita. LaRbp38 é uma proteína exclusiva de protozoários tripanosomatídeos, entre os quais estão os agentes etiológicos da leishmaniose, uma doença endêmica presente em diversas regiões do Brasil. Novos casos da doença vêm aumentando progressivamente, principalmente entre indivíduos imunocomprometidos e por isso a Organização Mundial da Saúde tem incentivado a busca de novos alvos para desenvolver drogas que eliminem eficazmente o parasita. LaRbp38 é uma proteína codificada por um gene nuclear, que parece exercer diferentes funções nas maquinarias de replicação nuclear e mitocondrial. Foi primeiramente descrita como proteína estabilizadora de RNA mitocondrial e parece estar envolvida com a replicação de DNA mitocondrial. Em Leishmania, LaRbp38 também interage in vivo com DNA mitocondrial, com seqüências ricas em GT e com DNA telomérico simples e dupla fita. A análise estrutural da proteína não indica a presença de nenhum domínio canônico de interação a ácidos nucléicos. Para dar inicio aos experimentos, a primeira estratégia foi desenhar mutantes delecionais da proteína de L. amazonensis (LaRbp38) de forma que cada um representa uma sobreposição do outro. Cada mutante, nomeados mut1, mut2, mut3, mut4 e mut5, foram subclonados em vetor de expressão bacteriano para produção de polipeptídios recombinantes. Em seguida os polipeptídios foram purificados e testados em western blotting, que mostra tanto LaRbp38 quantos os 5 mutantes sendo reconhecidas pelo soro antLLaRbp38. Ensaios in vitro de interação proteína-DNA (EMSA), usando DNA telomérico simples fita Te11, dupla fita...