PCL-1, uma ciclina multifuncional envolvida na regulação do metabolismo do glicogênio, germinação, divisão celular e na resposta ao estresse por cálcio em Neurospora crassa - Candido, Thiago de Souza [UNESP] (2016)
O fungo Neurospora crassa tem sido amplamente usado como um organismo modelo para os aspectos fundamentais da biologia dos eucariotos. Neste trabalho, foi investigado o papel funcional de uma ciclina de N. crassa (PCL-1), codificada pela ORF NCU08772 e ortóloga a Pcl10 de Saccharomyces cerevisiae. Na levedura, a proteína Pcl10, em conjunto com a proteína quinase dependente de ciclina Pho85, fosforila a enzima glicogênio sintase, a enzima regulatória da síntese de glicogênio. A fosforilação resulta na inativação da enzima e, portanto, em diminuição do acúmulo de glicogênio. A linhagem pcl-1 de N. crassa apresentou um atraso na germinação dos conídios e um retardo na progressão do ciclo celular quando comparado com a linhagem selvagem, sugerindo que esta ciclina pode regular o desenvolvimento e a divisão celular. Além disto, a linhagem nocauteada acumulou níveis mais elevados de glicogênio que a linhagem selvagem indicando o papel na regulação do metabolismo deste carboidrato. A fosforilação da enzima glicogênio sintase de N. crassa (GSN) foi analisada na linhagem nocaute através de análises de atividade enzimática, e os resultados mostraram que a GSN apresentou baixo índice de fosforilação, portanto alta atividade durante o crescimento, um resultado que pode explicar o alto acúmulo de glicogênio observado. Este resultado foi confirmado por análise de 2D-PAGE seguida por western blot, utilizando anticorpos anti-GSN. GSN apresentou na linhagem mutante isoformas menos fosforiladas que a enzima presente na linhagem selvagem. As proteínas recombinantes PHO85, PCL-1 foram utilizadas em ensaios de fosforilação in vitro da enzima GSN e os resultados mostraram que a enzima GSN foi fosforilada pelo complexo PHO85/PCL-1 no sítio putativo Ser636. O papel da ciclina na resposta ao cálcio foi investigado, e os resultados mostraram que a linhagem pcl-1 mostrou uma resistência ao estresse provocado por altas concentrações de cálcio quando comparada com a linhagem selvagem. Análises de expressão gênica por RT-qPCR foram realizadas e a linhagem pcl-1 mostrou estar envolvida na regulação de genes do metabolismo do cálcio. Os resultados indicam que a proteína PCL1 de N. crassa pode ser uma ciclina multifuncional e pode estar envolvida na regulação de vários processos celulares essenciais dependendo do ambiente.