Seleção e validação de genes de referência em condições de fotoperíodo artificial para indução do florescimento em Cana-de-açúcar - Santos, Paulo Henrique da Silva (2020)
A cana-de-açúcar é uma cultura de alto impacto no agronegócio do Brasil, principalmente pela produção de açúcar, álcool e bioeletricidade. O florescimento é um processo fisiológico importante para os programas de melhoramento genético na realização de cruzamentos, e indesejável aos produtores por proporcionar, em algumas cultivares, perda de acúmulo de sacarose prejudicando diretamente o rendimento dos canaviais. Desta forma, o conhecimento da expressão dos genes envolvidos no processo de indução (transição do meristema vegetativo para reprodutivo) é de extrema importância para o desenvolvimento de novas cultivares de cana-de-açúcar. Entretanto, o estudo da expressão de genes via PCR quantitativo em tempo (RT-qPCR) requer a escolha correta de genes de referência para normalizar a expressão dos genes alvos e, consequentemente, proporcionar a sua correta interpretação. O objetivo deste trabalho foi identificar genes de referência estáveis para validação de genes diferencialmente expressos via RT-qPCR. A partir de um experimento de RNA-Seq que investigou genes envolvidos na indução floral fotoperiódica na cultivar comercial de cana-de-açúcar IACSP96-7569 foi selecionado os genes alvos para validação. Oito diferentes candidatos a genes de referência (UBQ1, UBQ2, RPL, GAPDH, 25SrRNA1, TUB, EF1-α e TIPS-41) foram testados sob dois tratamentos fotoperiódicos (dia curto e dia longo), em dois momentos de desenvolvimento (correspondentes aos estágios iniciais da indução floral e formação de primórdios florais) em dois tecidos foliares (folha madura e folha imatura). A estabilidade dos candidatos a genes de referência em todas as condições foi avaliada pelos algoritmos NormFinder, BestKeeper e RefFinder e mostrou que UBQ1 e TUB foram os genes de referência mais estáveis. O par de genes de referência mais estável (UBQ1/TUB) e o menos estável (GAPDH/ 25SrRNA1) foi utilizado para normalizar a expressão de dois transcritos identificados como expressos diferencialmente a partir dos dados de RNA-Seq, PIL5 (“PHYTOCHROME INTERACTING FACTOR 3-LIKE 5”) e LHP1 (“LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN 1”) evidenciando os seus efeitos na resposta da expressão destes alvos. A comparação entre os resultados de expressão diferencial para estes dois alvos via RNA-Seq (FPKM) e RT-qPCR mostrou certa divergência sinalizando a importância da utilização de genes de referência adequados para validar os resultados do RNA-Seq. Além da seleção e validação de genes de referência, 13 genes alvos incluindo dois transcritos de função desconhecida foram avaliados via RT-qPCR, bem como a expressão do gene ortólogo ao FLOWERING LOCUS T (FT) ao longo de seis tempos de coleta em folha madura. A seleção e validação de genes de referência foram essenciais para a correta interpretação dos dados de RT-qPCR e servirão como um guia nos estudos de florescimento em cana-de-açúcar, especialmente aqueles voltados para a indução fotoperiódica da floração.