Enzimas degradadoras de parede celular de plantas produzidas por Rhizoctonia solani AG-1 IA: estudo da produção extracelular, purificação e caracterização - Bistratini, Erica Aparecida Santos [UNESP] (2016)
O presente trabalho configura-se no estudo da produção de enzimas degradadoras de parede celular de plantas (EDPCP), produzida por Rhizoctonia solani AG-1 IA obtido de culturas de arroz, braquiária e soja. As enzimas inicialmente estudadas foram celulases, β-glucosidase, xilanase, pectinases, amilase, lípases e proteases excretadas extracelularmente para o meio de cultivo. Foram avaliados 87 isolados de Rhizoctonia solani AG-1 IA, e adotado o cultivo em estado sólido utilizando farelo de trigo como fonte de carbono inicial para indução da produção extracelular das enzimas e avaliar o potencial dos isolados. O estudo do efeito da fonte de carbono foi realizado com cinco isolados de cada tipo de cultura, os quais foram cultivados em farelo de trigo, braquiária triturada, palha de soja, palha de milho, sabugo de milho e palha de arroz. Os melhores resultados para atividade xilanase foi do isolado PA_B1F6 obtido de culturas de braquiária quando cultivado em farelo de trigo (15,82 U mL-1), para CMCase e Avicelase os melhores resultados foram obtidos com os isolados MA_217 e TO_064 obtidos de culturas de soja quando cultivado em palha de milho (3,24 U mL-1) e palha de soja (2,91 U mL-1), respectivamente, e para β glucosidase os melhores resultados foram obtidos com o isolado TO_022 (2,75 U mL-1) obtido de cultura de soja cultivado em braquiária. A atividade de amilase foi superior no cultivo em farelo de trigo para o isolado ROB4D7 (142,88 U mL-1) obtido da cultura de braquiária e a pectinase do isolado PA_B1F6 (17,69 U mL-1) obtido da cultura de braquiária quando cultivado em substrato braquiária. O isolado MT_S085 obtido da cultura de soja apresentou melhor atividade de protease (1154,52 UAP mL-1) no cultivo com farelo de trigo e melhor atividade lípase (30,57 U mL-1) quando cultivado em substrato de braquiária. Os cinco isolados de cada tipo de cultura foram cultivados nos substratos que indicaram melhor atividade xilanase com avaliação do perfil de atividade ao longo do tempo. Os isolados obtidos de cultura de braquiária foram os que exibiram maiores produções de atividade da enzima xilanase. Os cultivos utilizando braquiária triturada e farelo de trigo como substrato foram os que proporcionaram maior atividade xilanolítica, a qual, em geral, ocorreu com 120h. A xilanase bruta produzida pelos isolados obtidos de cultura de arroz (RR_A23), braquiária (PA_B1F6) e soja (MT_S085) mostrou temperatura ótima em 55 °C. O pH ótimo dessas xilanases foi pH 6,0 para o isolado RR_A23, pH 6,5 para PA_B1F6 e pH 7,5 para MT_S085. O pH de estabilidade ficou na faixa de pH 4,0 a 7,5. Foi possível verificar que as xilanases produzidas por esses isolados diferem com o tipo de substrato utilizado no cultivo verificado eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE. Foram identificadas 35 sequências gênicas para a xilanase em Rhizoctonia solani, porém, não há até momento, sequência gênica descrita para xilanase produzida por Rhizoctonia solani AG-1 IA. Foram encontradas 4 sequências gênicas de Rhizoctonia solani AG-1 IA que apresentaram maior similaridade quando comparadas a sequências de xilanases descrita para outros grupos da mesma espécie. Desta forma foi realizada a purificação de uma xilanase produzida por Rhizoctonia solani AG-1 IA isolado da cultura de braquiária PA_B1F6. O cultivo em estado sólido foi realizado utilizando 5g de farelo de trigo com 0,5g de xilana e a purificação dessa xilanase necessitou de concentração por ultra filtração, precipitação com etanol e troca iônica em Hitrap SP Sepharose FF, para recuperar 4% da atividade inicial. A massa molecular foi estimada em 33,11 kDa. A xilanase purificada apresentou atividade ótima a 55 °C e maior atividade em pH 6,5. A enzima sofreu inibição por íons e agentes químicos e os parâmetros cinéticos para Km, Vmax, utilizando xilana de bétula (birchwood), como substrato foram 1,42 mg mL-1, 1415 mol L-1 mim-1, respectivamente.