Caracterização estrutural da hemoglobina extracelular de Amynthas gracilis (HbAg) por diferentes técnicas biofísicas - Oliveira, Jonathan Brito Souza de (2018)
As hemoglobinas extracelulares apresentam alta estabilidade oligomérica, resistência à oxidação, cooperatividade e afinidade para ligar oxigênio, além do potencial uso em aplicações biotecnológicas como substituto sanguíneo e biossensores de contaminação ambiental. Devido a estas propriedades, os objetivos desta dissertação foram caracterizar a estrutura e a estabilidade da hemoglobina extracelular gigante do anelídeo Amynthas gracilis (HbAg) por diferentes técnicas biofísicas, tais como, absorção ótica, intensidade de espalhamento de luz (LSI), espalhamento de luz dinâmico (DLS), eletroforese SDS-PAGE, ultracentrifugação analítica (AUC), espectrometria de massas por tempo de voo (MALDI-TOF-MS) e microscopia de força atômica (AFM). Em pH 7,0, a HbAg apresentou espectro de absorção ótica com máximo em 415 nm (banda de Soret) e em 540 e 575 nm (bandas Q). A alcalinização do meio deslocou os máximos de absorção para 405 nm e uma única banda Q alargada em 540 nm, devido à oxidação do grupo heme. O perfil proteico apresentado pela HbAg por eletroforese SDS-PAGE foi semelhante, mas não igual a hemoglobina extracelular de Glossoscolex paulistus (HbGp). A HbAg apresentou três bandas com massa molar (MM) entre 25-37 KDa associadas as cadeias L, enquanto a HbGp apresenta apenas duas bandas nesta faixa de massa. As análises dos dados de MALDI-TOF-MS mostraram que a HbAg apresenta quatro isoformas para o monômero d (d1 - d4) com MM entre 16,2-16,8 kDa, três linkers (L1, L2 e L3), 25,8-26,8 kDa, duas isoformas para o trímero abc e uma única isoforma para o tetrâmero abcd (67,7 kDa). Por AUC foi determinada a MM da HbAg na sua forma íntegra de 3,9 MDa, sendo este valor superior a HbGp (3,6 MDa). O maior valor de MM observado é associado a auto-agregação da HbAg em função do tempo de estocagem. O valor de ponto isoelétrico (pI) estimado por Potencial Zeta foi de 6,0 ± 0,3. A HbAg nativa apresenta um diâmetro hidrodinâmico (Dh) de 28 nm determinado por DLS. Porém, em pH menor que 6,5 a proteína mostrou tendência em formar agregados, já em pH acima de 8,0 a hemoglobina sofreu dissociação concomitante com agregação. A microscopia de força atômica (AFM) de filmes de HbAg em pH 7,0 revelou altura entre 15-20 nm que foi associado a dois discos hexagonais sobrepostos. Estudos iniciais de atividade peroxidase (POD) indicaram maior estabilidade da HbAg frente altas concentrações de peróxido de hidrogênio (H2O2) em relação a HbGp. Por fim os resultados apresentados nesta dissertação mostram um grande avanço na caracterização da HbAg, uma hemoglobina extracelular gigante até então não relatada na literatura. Adicionalmente possibilitou a criação de novas vertentes de estudos que no futuro poderão resultar na criação de produtos de grande aplicação biotecnológica, tais como biossensores destinados às áreas médica e ambiental, além de produtos de suprimento de oxigênio para tecidos sob condição de hipóxia.