Investigação da função biológica dos eventos de arm switching de microRNAs e sua potencial associação com a metilação de RNA m6A utilizando zebrafish como organismo modelo - Oliveira, Arthur Casulli de (2021)
Os microRNAs (miRNAs) são atualmente conhecidos como uma ampla classe de moléculas de RNAs reguladores da expressão gênica. Durante a biogênese, uma fita ("braço") do miRNA duplex é preferencialmente selecionada como um miRNA funcionalmente maduro, enquanto a outra fita é usualmente degradada. Eventos de arm switching ocorrem quando há mudança na preferência do braço selecionado. Isso se reflete na alteração do braço identificado como transcrito funcional, e varia de forma bastante dinâmica entre estágios do desenvolvimento, tipos de tecidos e mesmo entre espécies. Devido às particularidades de seu mecanismo de ação, os arm switching concedem aos miRNAs um ampliado potencial regulatório ao modificar o conjunto de alvos e, comumente, os processos biológicos por eles regulados. Entretanto, os mecanismos moleculares que promovem episódios de arm switching ainda necessitam ser melhor caracterizados. A identificação de metilações m6A em pri-miRNAs de linhagens celulares humanas reportada na literatura forneceu indícios de que este tipo de metilação poderia estar envolvida no processo de arm switching, principalmente devido à alteração que m6A promove na estrutura secundária de RNAs. Para testar esta hipótese, utilizamos o zebrafish, um vertebrado modelo, para avaliar se a metilação m6A poderia estar influenciando na ocorrência de arm switching nesta espécie. Para isso, confrontamos o perfil global de expressão dos braços 5p e 3p dos miRNAs pela análise de uma ampla coleção de dados de RNA-seq de períodos iniciais do desenvolvimento embrionário e diversos tecidos adultos de zebrafish obtidos da literatura. Adicionalmente, aplicamos a técnica de sequenciamento de metilações m6A (m6A-seq) no transcriptoma para identificar potencial correlação entre os picos de metilação presentes nos miRNAs e os eventos de arm switching identificados. Este conjunto de análises nos conduziu à inédita identificação de 14 eventos de arm switching em zebrafish. Pelo estudo detalhado destes casos e sua comparação aos eventos descritos em outras espécies verificamos que eventos de arm switching estão majoritariamente associados ao desenvolvimento ontogenético dos vertebrados. Adicionalmente, nossas análises sugerem que a expressão diferencial de isoformas de miRNAs (isomiRs) pode ser um importante modulador na prevalência dos braços. Também demonstramos, via análises de predição de alvos e enriquecimento funcional, que os eventos de arm switching de fato potencializam a regulação exercida pelos miRNAs, ao aumentarem o número de genes alvos, redes regulatórias e funções biológicas aos quais estão associados. No entanto, surpreendentemente, a análise criteriosa dos dados de m6A-seq nos forneceu indícios de que os pri-miRNAs de zebrafish não são efetivamente metilados, ainda que contenham sítios de metilação m6A em suas sequências. A discrepância entre os resultados obtidos neste trabalho e aqueles reportados em humanos e, mais recentemente, em Arabidopsis thaliana, sugerem que pressões seletivas atuantes na biogênese dos miRNAs poderiam estar ocorrendo em diferentes estágios nestas espécies. Ainda, considerando dados recentes da literatura sobre a interação entre a proteína efetora de metilações m6A e moléculas de RNA, conjecturamos que a estrutura secundária dos pri-miRNAs pode ser um fator permissivo desta modulação. Nesse contexto, concluímos que o arm switching é um fenômeno conservado e que está majoritariamente associado ao desenvolvimento ontogenético dos organismos. Também não encontramos evidências de que a metilação m6A interfira na prevalência dos braços de miRNAs em zebrafish, dada sua ausência aparente nos transcritos de pri-miRNAs desta espécie. Os resultados obtidos neste estudo trazem novas contribuições para a compreensão de mecanismos regulatórios inerentes à atividade funcional de miRNAs. Adicionalmente, fornecem subsídios para pesquisas futuras interessadas em explorar os mecanismos moleculares subjacentes às diferentes taxas de metilação e sua interferência na função e dinâmica evolutiva dos miRNAs nos metazoários.