Busca de biomoléculas com potencial biotecnológico em database metagenômico por sequence-driven - Lima, Natália Sarmanho Monteiro [UNESP] (2017)
O mercado industrial está se tornando cada vez mais dependente do uso de enzimas como catalisadores. Dentre as enzimas utilizadas industrialmente estão as de origem microbiana, por serem ativas nas mais diversas condições. As lacases são enzimas com alto potencial, pois atuam sobre diversos compostos, o que possibilita uma vasta diversidade de possíveis aplicações. Entre as formas de prospecção de novas enzimas microbianas, encontra-se a metagenômica. Diante disto, foi realizada a busca por potenciais lacases seguindo uma estratégia “sequence-driven” em uma base de dados metagenomicos composta por amostras de diversos ambientes, pertencente ao Laboratório de Bioquímica de Microrganismos e Plantas (LBMP). As ORFs previamente anotadas por similaridade de sequências e domínios conservados como possíveis “Multicopper oxidases” (grupo no qual se encontram as lacases) foram prospectadas pela região conservada para lacases L3 (HLHGH). Esta estratégia retornou três ORFs, a ORF50MF; a ORF51ME e a ORF13SE (lacmeta), as quais foram clonadas e submetidas as análises de super-expressão e purificação. LacMeta, similar em 82% com a sequência de proteína hipotética de Streptomyces rubidus [WP_069465126.1], foi a proteína que apresentou o melhor resultado de expressão e purificação, sendo então submetida a caracterização cinética. A proteína fusionada a uma cauda de hexa-histidina foi purificada na forma homo-trimérica, com 107 kDa, e apresentou atividade ótima em pH ácido para o substrato ABTS, para o qual obteve os parâmetros catalíticos kcat, Km e Vmax iguais a 1,85 (±0,07) min-1; 4,04 mM (±0,37) e 24,43 (±0,94) μM min-1, respectivamente. Quanto à estabilidade de estocagem, a enzima apresentou considerável estabilidade temporal, permanecendo com 50% da atividade após 150 dias a 4°C na presença de glicerol 5% como estabilizador estrutural. A enzima LacMeta apresentou atividade em uma ampla faixa de temperatura, atuando entre 10-60 °C com atividade acima de 50%. Sob o aspecto de aplicação biotecnológica, a enzima demonstrou elevado potencial para o tratamento de água residual de indústria têxtil, uma vez que foi capaz de degradar sete corantes de cinco classes distintas sem a presença de um mediador redox.