Respostas oocitárias ao estresse térmico - Latorraca, Lais Barbosa (2019)
A série de eventos desencadeados durante o período de maturação oocitária é muito susceptível ao estresse ambiental. Condições adversas tais como agentes pró-oxidantes e temperatura ambiente comprometem a função oocitária, reduzindo a capacidade de fertilização e o posterior desenvolvimento embrionário. O efeito negativo do estresse térmico sobre a fertilidade de bovinos já foi bem caracterizado. Entre os efeitos celulares do estresse térmico no oócito bovino podemos destacar a desorganização do citoesqueleto, aumento na produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), danos mitocondriais e ativação da morte celular por apoptose. Um efeito conservado do choque térmico em diferentes tipos celulares é a desnaturação de proteínas, ativando mecanismos de proteção no citoplasma celular e no retículo endoplasmático (RE) para manutenção da proteostasis. O RE funciona como sensor de estresse ambiental ativando a Unfolded Protein Response (UPR), podendo desencadear autofagia e/ou apoptose, dependendo da intensidade do estresse. Apesar da importância do RE para a função oocitária, os efeitos do choque térmico nesta organela nunca foram investigados. Portanto, os objetivos gerais desta dissertação foram determinar o papel do estresse do RE na função de oócitos bovinos submetidos ao choque térmico (Capítulo 2) e o papel da autofagia na expressão gênica e competência de desenvolvimento de oócitos bovinos submetidos a choque térmico durante a maturação in vitro (MIV) (Capítulo 3). Para os estudos do RE os complexos cumulus-oócito (CCOs) foram inicialmente distribuídos nos seguintes grupos: 0 h (oócitos imaturos), Controle (MIV à 38,5ºC por 22 h) e Choque Térmico (MIV à 41ºC por 16 h seguido de 6 h à 38,5ºC). Após a MIV, os oócitos desnudos foram corados para determinação da progressão meiótica e localização do RE em microscópio confocal. A exposição de oócitos bovinos ao choque térmico reduziu a taxa de maturação e alterou negativamente o padrão de localização do RE em relação ao controle. Na segunda série de experimentos, os oócitos foram submetidos as temperaturas Controle e Choque térmico em meio MIV, controle veículo [0.00096% (v/v) DMSO] e meio Salubrinal (400 nM de Salubrinal - SA: inibidor do estresse do RE) para determinação da síntese proteica total e abundância de marcadores proteicos da via de estresse RE e função oocitária. Em alguns modelos foi também utilizado o indutor do estresse do RE (5 µg/mL de Tunicamycin – TM) como controle positivo. A exposição de CCOs ao choque térmico em meio MIV não reduziu a capacidade de síntese proteica do oócito. Porém, a inibição do estresse do RE durante o choque térmico aumentou a síntese de novo de proteínas em relação ao grupo controle (MIV à 38,5ºC). Além disso, TM reduziu a síntese proteica em comparação aos demais grupos. Na avaliação por western blotting, não houve diferença na abundância das proteínas sXBP1 (marcador de estresse do RE) e ubiquitina (marcador de degradação proteica) entre os grupos. No entanto, a proteina Caspase 3 (marcador de apoptose) foi aumentada em oócitos maturados com TM em comparação à SA-41ºC, demonstrando que o estresse de RE pode induzir a morte celular. Do ponto de vista funcional, o choque térmico em meio MIV não alterou o padrão normal de fecundação (2 pró-núcleos- PN). No entanto, a suplementação com DMSO teve efeito protetor em oócitos estressados aumentando a porcentagem de oócitos com 2 PN. A exposição ao choque térmico causou um retardo na cinética do desenvolvimento embrionário reduzindo a porcentagem de embriões no estágio de 2-células às 29, 35 e 41 horas após a inseminação (hai), assim como a clivagem de 32 – 48 hai. Nos dias 3 e 8 após a inseminação, as taxas de clivagem e blastocisto foram também reduzidas em oócitos estressados. A adição de DMSO recuperou parte dos efeitos deletérios do choque térmico na cinética embrionária inicial e desenvolvimento a blastocisto, mascarando o real efeito da inibição do estresse do RE. No capítulo 3, estudou-se o impacto da inibição da autofagia na competência de de desenvolvimento e expressão gênica em oócitos bovinos expostos ao choque térmico durante a MIV. O experimento 1 determinou o efeito da inibição da autofagia na competência de desenvolvimento de oócitos bovinos submetidos ao choque térmico. Os CCOs foram maturados nas temperaturas Controle (38,5ºC por 22 h) e Choque Térmico (41ºC por 16 h seguido por 38,5ºC por 6h) na presença de 0 e 10 mM 3MA (3-metiladenina; inibidor de autofagia). Após a MIV, os oócitos foram submetidos à FIV e CIV por 8 dias. A inibição da autofagia em oócitos expostos ao choque térmico durante a MIV reduziu as taxas de clivagem e blastocisto em comparação com os outros grupos. O experimento 2 foi conduzido com o mesmo delineamento fatorial 2 x 2 para determinar o efeito da inibição da autofagia na expressão gênica em oócitos expostos ao choque térmico. A inibição da autofagia durante o choque térmico reduziu a abundância de RNAm para genes relacionados a maturação oocitária (BMP15, HAS2 e GREM1), metabolismo lipídico e energético (SREBF2 e MTIF3), crescimento celular (IGF2) e resposta ao choque térmico (HSF1 e HSPA1A). Conclui-se que o choque térmico durante a MIV afeta negativamente a progressão meiótica, a distribuição do RE e retarda a cinética de desenvolvimento embrionário reduzindo as taxas de clivagem e blastocisto. A inibição da autofagia modulou processos funcionais importantes no oócito bovino, tornando-o mais suscetível aos efeitos deletérios do choque térmico. Dessa forma, a autofagia é uma resposta oocitária pró-sobrevivência em condições de estresse. No entanto, experimentos adicionais são necessários para demonstrar a importância do estresse do RE em oócitos submetidos ao choque térmico.