Structural studies of PLA2-like toxins and development of the structure solution method sequence slider - Borges, Rafael Junqueira [UNESP] (2017)
As fosfolipases A2 (PLA2s) são um dos maiores constituintes protéicos do veneno botrópico e um dos responsáveis pela necrose muscular, consequência esta não eficazmente neutralizada pela administração do soro antiofídico. Estas proteínas são tóxicas através do rompimento ou perturbação da membrana celular em um mecanismo catalítico dependente de cálcio e outro independente, sendo este último não totalmente elucidado. Usualmente, estas toxinas são obtidas diretamente do veneno das serpentes, sendo sua purificação um desafio pela co-existência de diferentes isoformas. O objetivo desta tese foi compreender o mecanismo miotóxico independente de cálcio através de estudos estruturais e propor nova metodologia que trate de dados cristalográficos de toxinas provenientes de amostras impuras, chamada SEQUENCE SLIDER. Para tanto, cristalografia e outras técnicas biofísicas, como espalhamento de raios X a baixo ângulo, serão utilizados para estudar três miotoxinas ofídicas em estado nativo e complexado com produtos naturais e inibidores. Nós propusemos medidas locais e globais para caracterizar e relacionar a estrutura dessas toxinas a função. Com o SEQUENCE SLIDER, pudemos elucidar as estruturas de toxinas inéditas cuja sequência era parcialmente conhecida. Esta nova metodologia proposta consiste em avaliar diferentes cadeias laterais contra o coeficiente de correlação em espaço real calculado a partir dos dados cristalográficos. Em paralelo, desenvolvemos o SEQUENCE SLIDER no âmbito do método cristalográfico ab initio ARCIMBOLDO com objetivo de aumentar seu escopo a dados com resolução mais baixa que 2 Å. Nestes casos, diferentes hipóteses de sequências para as soluções parciais de polialanina são avaliadas mutualmente e enviadas a autotraçamento até que grande parte da estrutura seja faseada. Pudemos melhorar a compreensão do mecanismo miotóxico e desenvolver um programa que poderá auxiliar resolução de estruturas cristalográficas desafiadoras.