O papel dos miRNA na infecção de leucócitos esplênicos de cão por Leishmania Infantum - Melo, Larissa Martins (2018)
A leishmaniose visceral canina (LV) no Brasil representa um grave problema de saúde pública. Na LV a supressão imune celular é determinante da progressão da doença. Estudos mostraram que a regulação da resposta imune depende de miRNAs. O objetivo deste estudo foi a caracterização dos miRNAs em leucócitos esplênicos (LE) de cães naturalmente infectados por L. infantum. Este estudo foi realizado em Araçatuba, região endêmica para LV canina (LVC). Um grupo de 4 cães saudáveis e 8 cães com LVC foi estudado. O RNA foi extraído do LE usando o Kit Mirvana (Invitrogen™) de acordo com as recomendações do fabricante. O RNA foi quantificado usando um fluorômetro (Qubit 3.0, Invitrogen™) o grau de pureza realizado por eletroforese capilar (Bioanalyser, Agilent ™), as amostras foram então armazenadas a -80°C. O miRNA foi preparado para o microarranjo usando o FlashTag Biotina HSR RNA Labeling Kit (Affymetrix ™). O microarranjo foi realizado usando o Affymetrix ™ miRNA 4.1 Strip de acordo com as recomendações do fabricante. A produção de cDNA foi realizada usando o kit miScript RT II (Qiagen™). Os miRNAs diferencialmente expressos foram validados por qPCR utilizando iniciadores para miRNAs de cães inventariados (Qiagen™) de acordo com recomendação do fabricante. Os miRNAs validados foram analisados no programa Ingenuity Pathway Analysis (IPA, Qiagen™). Após a análise das vias, os LE de cães infectados foram transfectados com miR21 usando miScript miRNA Mimics e Inhibitor (Qiagen™) de acordo com as recomendações do fabricante. Após a transfecção, o factor de transcrição T-bet e GATA 3 e a carga parasitária foi avaliada por citometria de fluxo e a IL-12 foi quantificada por ELISA Kit (R & D Systems™). A análise do microarray foi realizada no Expression Console, no Transcriptome Analysis Console (Affymetrix™) por ANOVA, qPCR foi analisada pelo teste de Mann-Whitney, a via canônica de miRNA diferentemente expressa em IPA com o teste de Fisher, o fator de transcrição, carga parasitária e expressão de IL-12 foi analisada pelo teste de Friedman, foi utilizado o nível de significância de p<0,05. Verificou-se que 7 miRNAs tiveram expressão alterada em cães infectados em comparação com cães saudáveis: miR-148a, miR-21, miR-7, miR-615 foram “upregulated” e miR-150, miR-125a e miR-125b foram “downregulated”. O miR148a, miR615 e miR21 validaram os resultados do microarranjo. O IPA mostrou 114 vias reguladas por esses miRNAs, incluindo vias que regulam a imunidade. Após a transfecção inibimos o miRNA 21 e observamos um aumento de IL-12, da razão Th1 e Th2 e uma diminuição da carga parasitária. Concluímos, que o miR 21 interfere na resposta imunológica de cães infectados por L. infantum, inibindo a resposta do tipo celular. Essas informações podem ajudar na identificação de alvos terapêuticos na LVC.